RNA-fluorescens in situ-hybridisering til lang ikke-kodende RNA-lokalisering i humane osteosarkomceller
Summary
Denne protokol beskriver en metode til RNA-fluorescens in situ-hybridisering til lokalisering af lncRNA’erne i humane osteosarkomceller.
Abstract
De vigtige roller af lange ikke-kodende RNA’er (lncRNA’er) i kræft er blevet undersøgt, såsom regulering af spredning, epitel-mesenkymal overgang (EMT), migration, infiltration og autofagi af kræftceller. Lokaliseringsdetektion af lncRNA’er i celler kan give indsigt i deres funktioner. Ved at designe den lncRNA-specifikke antisensekædesekvens efterfulgt af mærkning med fluorescerende farvestoffer kan RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) anvendes til at detektere cellulær lokalisering af lncRNA’er. Sammen med udviklingen af mikroskopi giver RNA FISH-teknikkerne nu endda mulighed for visualisering af de dårligt udtrykte lncRNA’er. Denne metode kan ikke kun detektere lokaliseringen af lncRNA’er alene, men også detektere colokalisering af andre RNA’er, DNA eller proteiner ved anvendelse af dobbeltfarvet eller flerfarvet immunofluorescens. Her har vi inkluderet den detaljerede eksperimentelle operationsprocedure og forholdsregler for RNA FISH ved at bruge lncRNA lille nukleolært RNA-værtsgen 6 (SNHG6) i humane osteosarkomceller (143B) som et eksempel for at give en reference til forskere, der ønsker at udføre RNA FISH-eksperimenter, især lncRNA FISH.
Introduction
Vores forståelse af det menneskelige genom er blevet stærkt udvidet af de seneste fremskridt inden for helgenomteknologi. Ca. 93% af det menneskelige genom kan transkriberes til RNA’er, men kun 2% af RNA’erne kan oversættes til proteiner; de resterende 98% af RNA’er, der ikke har nogen proteinoversættelsesfunktion, kaldes ikke-kodende RNA (ncRNA)1. Som en klasse af ikke-kodende RNA’er (ncRNA’er) har lange ncRNA’er (lncRNA’er), der indeholder over 200 nukleotider2, tiltrukket stigende opmærksomhed på grund af deres involvering i mange fysiologiske og patologiske processer i cellerne, såsom differentiering, cykluskontrol, apoptose, migration og invasion 3,4,5. LncRNA’er spiller deres roller gennem forskellige mekanismer, såsom regulering af kromatinstruktur og nuklear genekspression, styring af mRNA-splejsningsprocessen og posttranskriptionel modifikation6. LncRNA’er regulerer forekomsten, udviklingen og metastasen af maligniteter på både transkriptionelle og posttranskriptionelle niveauer. Transskriptionel regulering realiseres i kernen ved at påvirke RNA-transkription via binding til kromosomale strukturer, mens posttranskriptionel regulering realiseres i cytoplasmaet ved at kontrollere målgenerne via en endogen kompetitiv RNA (ceRNA) mekanisme 5,7,8. CeRNA har afsløret en ny mekanisme for RNA-interaktion, nemlig at lncRNA’er kan fungere som en svamp til at adsorbere miRNA’er og hæmme den miRNA-medierede nedbrydning af beslægtede målgener9. Derfor er oplysningerne om subcellulær lokalisering af lncRNA’er, uanset om et specifikt lncRNA er placeret i cytoplasma eller kernen, vigtige for at hjælpe med at identificere deres biologiske funktioner.
På nuværende tidspunkt detekteres lncRNA-lokalisering hovedsageligt ved to metoder, den ene er ved kerne / cytoplasmafraktionsisoleringsassay, og den anden er ved RNA FISH. I førstnævnte ekstraheres RNA’er i henholdsvis de cytoplasmatiske og de nukleare fraktioner, og derefter udføres PCR-amplifikation med specifikke lncRNA-primere for at detektere forholdet mellem lncRNA’er i cytoplasma og kerne. Fordelen ved denne metode er tidseffektivitet, mens ulempen er, at den faktiske lncRNA-lokalisering ikke afspejles direkte af den relative andel af lncRNA’er i cytoplasma og kerne. RNA FISH kan detektere lncRNA-lokalisering i celler gennem design af lncRNA-specifikke antisensekædesekvenser efterfulgt af mærkning med fluorescerende farvestoffer10. RNA FISH-metoderne er blevet forbedret med fremskridt inden for sondeteknikker og detektionsmetoder, herunder fluoroformærkede multiple oligo-sondesæt11, LNA-sonder12 og forgrenede DNA-sonder (bDNA)13. RNA FISH kan ikke kun detektere lokaliseringen af lncRNA, men også detektere colokalisering af andre RNA’er, DNA eller proteiner ved hjælp af dobbeltfarvet eller flerfarvet immunofluorescens14.
I dette arbejde har vi inkluderet den detaljerede intracellulære lokaliseringsdetekteringsprotokol for lncRNA lille nukleolært RNA-værtsgen 6 (SNHG6) i osteosarkomceller (143B) af RNA FISH som et eksempel. SNHG6 er et 600-730 nukleotid-lncRNA i sin modne splejsede form og identificeret som et nyt onkogen i forskellige humane kræftformer, herunder kolorektal cancer, gastrisk kræft, ovarie klarcellekarcinom, osteosarkom og hepatocellulært karcinom15,16,17,18. Undersøgelser har bekræftet involvering af SNHG6 i kræftcellers biologiske adfærd, såsom proliferation, EMT og autofagi, og vist cytoplasmatisk lokalisering af SNHG6, hvor det kan påvirke målgenerne ved at binde (svampe) miRNA’erne15,16,17. Denne detaljerede detektionsprotokol for SNHG6 intracellulær lokalisering af RNA FISH er præsenteret heri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne RNA FISH-protokol kan ikke kun detektere lokaliseringen af lncRNA’er i celler, men også detektere colokalisering af andre RNA’er, DNA eller proteiner i celler, som også kan bruges til at detektere placeringen af lncRNA’er i paraffinindlejrede væv. Den specifikke protokol i sådanne tilfælde er imidlertid anderledes, fordi det paraffinindlejrede væv skal afvokses21. Denne eksperimentelle procedure kan anvendes i 48- eller 96-brøndplader, men 384-brøndplader er for små til at blive bru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde understøttes af tilskud fra (1) National Key R&D Program of China (2020YFE0201600); 2) National Nature Science Foundation (81973877 og 82174408) 3) Shanghai Collaborative Innovation Center for industriel transformation af TCM-forberedelse til hospitaler (4) Forskningsprojekter inden for budgettet for Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
- Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
- Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
- Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
- Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
- Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
- Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
- Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
- Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
- Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
- Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
- Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
- Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
- Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
- Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
- Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
- Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).
