मानव ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं में लंबे समय तक गैर-कोडिंग आरएनए स्थानीयकरण के लिए सीटू संकरण में आरएनए प्रतिदीप्ति
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल मानव ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं में lncRNAs स्थानीयकरण करने के लिए स्वस्थानी संकरण में शाही सेना प्रतिदीप्ति की एक विधि का वर्णन करता है.
Abstract
कैंसर में लंबे समय तक गैर-कोडिंग आरएनए (एलएनसीआरएनए) की महत्वपूर्ण भूमिकाओं का अध्ययन किया गया है, जैसे कि प्रसार, उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी), प्रवासन, घुसपैठ और कैंसर कोशिकाओं के ऑटोफैगी को विनियमित करना। कोशिकाओं में lncRNAs का स्थानीयकरण पता लगाने उनके कार्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबलिंग के बाद lncRNA-विशिष्ट एंटीसेंस चेन अनुक्रम को डिजाइन करके, स्वस्थानी संकरण (FISH) में RNA प्रतिदीप्ति को lncRNAs के सेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है। माइक्रोस्कोपी के विकास के साथ-साथ, आरएनए फिश तकनीक अब खराब व्यक्त एलएनसीआरएनए के दृश्य के लिए भी अनुमति देती है। यह विधि न केवल अकेले lncRNAs के स्थानीयकरण का पता लगा सकती है, बल्कि डबल-रंग या बहुरंगी इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके अन्य RNAs, डीएनए या प्रोटीन के सहस्थानीयकरण का भी पता लगा सकती है। यहां, हमने एक उदाहरण के रूप में मानव ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं (143B) में lncRNA छोटे न्यूक्लियोलर RNA होस्ट जीन 6 (SNHG6) का उपयोग करके RNA FISH की विस्तृत प्रयोगात्मक संचालन प्रक्रिया और सावधानियों को शामिल किया है, ताकि उन शोधकर्ताओं के लिए एक संदर्भ प्रदान किया जा सके जो RNA FISH प्रयोग करना चाहते हैं, विशेष रूप से lncRNA FISH।
Introduction
पूरे जीनोम प्रौद्योगिकी में हालिया प्रगति से मानव जीनोम की हमारी समझ का बहुत विस्तार हुआ है। मानव जीनोम के लगभग 93% को आरएनए में स्थानांतरित किया जा सकता है, लेकिन आरएनए के केवल 2% का प्रोटीन में अनुवाद किया जा सकता है; शेष 98% आरएनए जिनके पास कोई प्रोटीन अनुवाद कार्य नहीं है, उन्हें गैर-कोडिंग आरएनए (एनसीआरएनए)1 कहा जाता है। नॉनकोडिंग आरएनए (एनसीआरएनए) के एक वर्ग के रूप में, 200 से अधिक न्यूक्लियोटाइड्स2 युक्त लंबे एनसीआरएनए (एलएनसीआरएनए) ने कोशिकाओं की कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में उनकी भागीदारी के कारण बढ़ते ध्यान को आकर्षित किया है, जैसे भेदभाव, चक्र नियंत्रण, एपोप्टोसिस, प्रवास, और आक्रमण 3,4,5. LncRNAs क्रोमैटिन संरचना और परमाणु जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने, mRNA splicing प्रक्रिया को नियंत्रित करने, और पोस्टट्रांसक्रिप्शनल संशोधन6 के रूप में विभिन्न तंत्रों के माध्यम से अपनी भूमिका निभाते हैं। LncRNAs ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्टट्रांसक्रिप्शनल दोनों स्तरों पर दुर्दमताओं की घटना, विकास और मेटास्टेसिस को नियंत्रित करते हैं। क्रोमोसोमल संरचनाओं के लिए बाध्यकारी के माध्यम से आरएनए प्रतिलेखन को प्रभावित करके नाभिक में ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का एहसास होता है, जबकि अंतर्जात प्रतिस्पर्धी आरएनए (सीईआरएनए) तंत्र 5,7,8 के माध्यम से लक्ष्य जीन को नियंत्रित करके साइटोप्लाज्म में पोस्टट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का एहसास होता है। CeRNA शाही सेना बातचीत के एक नए तंत्र का पता चला है, अर्थात् lncRNAs adsorb miRNAs के लिए एक स्पंज के रूप में कार्य और संबंधित लक्ष्य जीन9 के miRNA मध्यस्थता गिरावट को रोकने. इसलिए, एलएनसीआरएनए के उपकोशिकीय स्थानीयकरण के बारे में जानकारी, चाहे एक विशिष्ट एलएनसीआरएनए साइटोप्लाज्म या नाभिक में स्थित हो, उनके जैविक कार्यों की पहचान करने में मदद करने के लिए महत्वपूर्ण है।
वर्तमान में, lncRNA स्थानीयकरण मुख्य रूप से दो तरीकों से पता लगाया जाता है, एक नाभिक/साइटोप्लाज्म अंश अलगाव परख द्वारा है, और दूसरा आरएनए फिश द्वारा है। पूर्व में, साइटोप्लाज्मिक और परमाणु अंशों में आरएनए क्रमशः निकाले जाते हैं, और फिर साइटोप्लाज्म और नाभिक में एलएनसीआरएनए के अनुपात का पता लगाने के लिए विशिष्ट एलएनसीआरएनए प्राइमरों के साथ पीसीआर प्रवर्धन किया जाता है। इस पद्धति का लाभ समय दक्षता है, जबकि नुकसान यह है कि वास्तविक lncRNA स्थानीयकरण साइटोप्लाज्म और नाभिक में lncRNAs के सापेक्ष अनुपात से सीधे परिलक्षित नहीं होता है। आरएनए फिश फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबलिंग के बाद एलएनसीआरएनए-विशिष्ट एंटीसेंस चेन अनुक्रमों के डिजाइन के माध्यम से कोशिकाओं में एलएनसीआरएनए स्थानीयकरण का पता लगा सकताहै। आरएनए मछली विधियों फ्लोरोफोरे लेबल एकाधिक ओलिगो जांच सेट11, एलएनए जांच 12, और branched डीएनए (बीडीएनए) जांच13 सहित जांच तकनीकों और पता लगाने के तरीकों में प्रगति के साथ सुधार किया गया है. आरएनए फिश न केवल एलएनसीआरएनए के स्थानीयकरण का पता लगा सकता है, बल्कि डबल-रंग या बहुरंगा इम्यूनोफ्लोरेसेंस14का उपयोग करके अन्य आरएनए, डीएनए, या प्रोटीन के सहस्थानीयकरण का भी पता लगा सकता है।
इस काम में, हमने एक उदाहरण के रूप में आरएनए फिश द्वारा ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं (143बी) में एलएनसीआरएनए छोटे न्यूक्लियोलर आरएनए होस्ट जीन 6 (एसएनएचजी 6) के विस्तृत इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण डिटेक्शन प्रोटोकॉल को शामिल किया है। SNHG6 अपने परिपक्व स्प्लिस्ड रूप में एक 600-730 न्यूक्लियोटाइड lncRNA है और कोलोरेक्टल कैंसर, गैस्ट्रिक कैंसर, डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा, ओस्टियोसारकोमा और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा15,16,17,18 सहित विभिन्न मानव कैंसर में एक उपन्यास ऑन्कोजीन के रूप में पहचाना जाता है। अध्ययनों ने कैंसर कोशिकाओं के जैविक व्यवहार, जैसे प्रसार, EMT, और ऑटोफैगी में SNHG6 की भागीदारी की पुष्टि की है, और SNHG6 के साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण को दिखाया है जहां यह miRNAs15,16,17 को बाध्यकारी (स्पॉन्जिंग) द्वारा लक्ष्य जीन को प्रभावित कर सकता है। आरएनए फिश द्वारा SNHG6 इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण का यह विस्तृत पता लगाने वाला प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह आरएनए फिश प्रोटोकॉल न केवल कोशिकाओं में एलएनसीआरएनए के स्थानीयकरण का पता लगा सकता है, बल्कि कोशिकाओं में अन्य आरएनए, डीएनए या प्रोटीन के सहस्थानीयकरण का भी पता लगा सकता है, जिसका उपयोग पैराफिन-एम्ब?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम (1) चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2020YFE0201600) से अनुदान द्वारा समर्थित है; (2) राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन (81973877 और 82174408); (3) अस्पताल टीसीएम तैयारी के औद्योगिक परिवर्तन के शंघाई सहयोगी नवाचार केंद्र; (4) शंघाई यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन (2021LK047) के बजट के भीतर अनुसंधान परियोजनाएं।
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
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