Ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA per la localizzazione di RNA non codificante lungo in cellule di osteosarcoma umano
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo di ibridazione in situ a fluorescenza dell’RNA per localizzare gli lncRNA in cellule di osteosarcoma umano.
Abstract
Sono stati studiati gli importanti ruoli degli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) nel cancro, come la regolazione della proliferazione, la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), la migrazione, l’infiltrazione e l’autofagia delle cellule tumorali. Il rilevamento della localizzazione degli lncRNA nelle cellule può fornire informazioni sulle loro funzioni. Progettando la sequenza della catena antisenso specifica per lncRNA seguita da marcatura con coloranti fluorescenti, è possibile applicare l’ibridazione in situ fluorescente dell’RNA (FISH) per rilevare la localizzazione cellulare degli lncRNA. Insieme allo sviluppo della microscopia, le tecniche RNA FISH ora consentono anche la visualizzazione degli lncRNA scarsamente espressi. Questo metodo non solo è in grado di rilevare la localizzazione dei soli lncRNA, ma anche di rilevare la colocalizzazione di altri RNA, DNA o proteine utilizzando l’immunofluorescenza bicolore o multicolore. Qui, abbiamo incluso la procedura operativa sperimentale dettagliata e le precauzioni di RNA FISH utilizzando il gene ospite 6 (SNHG6) dell’RNA nucleolare piccolo lncRNA in cellule di osteosarcoma umano (143B) come esempio, per fornire un riferimento per i ricercatori che desiderano eseguire esperimenti di RNA FISH, in particolare lncRNA FISH.
Introduction
La nostra comprensione del genoma umano è stata notevolmente ampliata dai recenti progressi nella tecnologia dell’intero genoma. Circa il 93% del genoma umano può essere trascritto in RNA, ma solo il 2% degli RNA può essere tradotto in proteine; il restante 98% degli RNA che non hanno funzione di traduzione delle proteine sono chiamati RNA non codificanti (ncRNA)1. Come classe di RNA non codificanti (ncRNA), gli ncRNA lunghi (lncRNA), contenenti oltre 200 nucleotidi2, hanno attirato una crescente attenzione a causa del loro coinvolgimento in molti processi fisiologici e patologici delle cellule, come il differenziamento, il controllo del ciclo, l’apoptosi, la migrazione e l’invasione 3,4,5. Gli LncRNA svolgono il loro ruolo attraverso vari meccanismi, come la regolazione della struttura della cromatina e dell’espressione genica nucleare, il controllo del processo di splicing dell’mRNA e la modificazione post-trascrizionale6. Gli LncRNA regolano l’insorgenza, lo sviluppo e la metastasi delle neoplasie maligne sia a livello trascrizionale che post-trascrizionale. La regolazione trascrizionale si realizza nel nucleo influenzando la trascrizione dell’RNA attraverso il legame alle strutture cromosomiche, mentre la regolazione post-trascrizionale si realizza nel citoplasma controllando i geni bersaglio tramite un meccanismo di RNA endogeno competitivo (ceRNA) 5,7,8. CeRNA ha rivelato un nuovo meccanismo di interazione con l’RNA, vale a dire che gli lncRNA possono agire come una spugna per adsorbire i miRNA e inibire la degradazione mediata dai miRNA dei geni bersaglio correlati9. Pertanto, le informazioni riguardanti la localizzazione subcellulare degli lncRNA, se uno specifico lncRNA si trova nel citoplasma o nel nucleo, sono importanti per aiutare a identificare le loro funzioni biologiche.
Attualmente, la localizzazione dell’lncRNA viene rilevata principalmente con due metodi, uno mediante il saggio di isolamento della frazione nucleo/citoplasma e l’altro mediante RNA FISH. Nel primo caso, gli RNA nella frazione citoplasmatica e nucleare vengono estratti rispettivamente, quindi l’amplificazione PCR viene eseguita con specifici primer di lncRNA per rilevare il rapporto tra lncRNA nel citoplasma e nel nucleo. Il vantaggio di questo metodo è l’efficienza temporale, mentre lo svantaggio è che l’effettiva localizzazione dell’lncRNA non si riflette direttamente nella proporzione relativa di lncRNA nel citoplasma e nel nucleo. RNA FISH è in grado di rilevare la localizzazione di lncRNA nelle cellule attraverso la progettazione di sequenze a catena antisenso specifiche per lncRNA seguite da marcatura con coloranti fluorescenti10. I metodi RNA FISH sono stati migliorati con i progressi nelle tecniche di sonde e nei metodi di rilevamento, tra cui i set di sonde oligo multiplemarcati con fluorofori 11, le sonde LNA 12 e le sonde a DNA ramificato (bDNA)13. RNA FISH è in grado non solo di rilevare la localizzazione di lncRNA, ma anche di rilevare la colocalizzazione di altri RNA, DNA o proteine utilizzando l’immunofluorescenza bicolore o multicolore14.
In questo lavoro, abbiamo incluso come esempio il dettagliato protocollo di rilevamento della localizzazione intracellulare del gene ospite 6 dell’RNA piccolo nucleolare dell’RNA lncRNA (SNHG6) in cellule di osteosarcoma (143B) mediante RNA FISH. SNHG6 è un lncRNA di 600-730 nucleotidi nella sua forma matura e identificata come un nuovo oncogene in diversi tumori umani, tra cui il cancro del colon-retto, il cancro gastrico, il carcinoma ovarico a cellule chiare, l’osteosarcoma e il carcinoma epatocellulare15,16,17,18. Gli studi hanno confermato il coinvolgimento di SNHG6 nei comportamenti biologici delle cellule tumorali, come la proliferazione, l’EMT e l’autofagia, e hanno mostrato la localizzazione citoplasmatica di SNHG6 dove può influenzare i geni bersaglio legando (spugnando) i miRNA15,16,17. Questo protocollo di rilevamento dettagliato della localizzazione intracellulare di SNHG6 da parte di RNA FISH è presentato di seguito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo RNA FISH non solo è in grado di rilevare la localizzazione degli lncRNA nelle cellule, ma anche di rilevare la colocalizzazione di altri RNA, DNA o proteine nelle cellule, che possono essere utilizzati anche per rilevare la posizione degli lncRNA nei tessuti inclusi in paraffina. Tuttavia, il protocollo specifico in questi casi è diverso perché i tessuti inclusi in paraffina devono essere decerati21. Questa procedura sperimentale può essere applicata in piastre da 48 o 96 poz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni provenienti da (1) il National Key R&D Program of China (2020YFE0201600); (2) la National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408); (3) Centro di innovazione collaborativa di Shanghai per la trasformazione industriale della preparazione alla MTC ospedaliera; (4) Progetti di ricerca nell’ambito del budget dell’Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai (2021LK047).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
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