ヒト骨肉腫細胞における長鎖ノンコーディングRNA局在化のためのRNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション
Summary
本プロトコルは、ヒト骨肉腫細胞のlncRNAを局在化させるRNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーションの方法を記述する。
Abstract
がん細胞の増殖、上皮間葉転換(EMT)、遊走、浸潤、オートファジーの調節など、がんにおける長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)の重要な役割が研究されています。細胞内のlncRNAの局在検出は、その機能に関する洞察を提供することができます。lncRNA特異的なアンチセンス鎖配列を設計し、その後に蛍光色素で標識することにより、RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)を適用してlncRNAの細胞局在を検出することができます。顕微鏡法の開発とともに、RNA FISH技術により、発現不良のlncRNAの可視化も可能になりました。この方法では、lncRNAの局在を単独で検出できるだけでなく、ダブルカラーまたはマルチカラーの免疫蛍光法を使用して、他のRNA、DNA、またはタンパク質の共局在を検出することもできます。ここでは、ヒト骨肉腫細胞(143B)におけるlncRNA小核小体RNA宿主遺伝子6(SNHG6)を例に、RNA FISH実験、特にlncRNA FISH実験を行いたい研究者の参考となるように、RNA FISHの詳細な実験操作手順と注意点を記載した。
Introduction
ヒトゲノムの理解は、近年の全ゲノム技術の進歩によって大きく拡大しています。ヒトゲノムの約93%はRNAに転写できますが、タンパク質に翻訳できるRNAはわずか2%です。タンパク質翻訳機能を持たないRNAの残りの98%は、ノンコーディングRNA(ncRNA)1と呼ばれます。200以上のヌクレオチド2を含む長鎖ncRNA(lncRNA)は、分化、周期制御、アポトーシス、遊走、浸潤など、細胞の多くの生理学的・病理学的プロセスに関与していることから、ノンコーディングRNA(ncRNA)のクラスとしてますます注目を集めています3,4,5。.LncRNAは、クロマチン構造や核内遺伝子発現の調節、mRNAスプライシングプロセスの制御、転写後修飾など、さまざまなメカニズムを通じてその役割を果たしています6。LncRNAは、転写レベルと転写後レベルの両方で悪性腫瘍の発生、発生、および転移を調節します。核内では染色体構造への結合を介してRNAの転写に作用することで転写制御が実現され、細胞質内では内因性競合RNA(ceRNA)機構を介して標的遺伝子を制御することで転写後制御が実現される5,7,8。CeRNAは、lncRNAがスポンジとしてmiRNAを吸着し、miRNAを介した関連標的遺伝子の分解を阻害するという、RNA相互作用の新しいメカニズムを明らかにしました9。したがって、lncRNAの細胞内局在に関する情報は、特定のlncRNAが細胞質または核に存在するかどうか、それらの生物学的機能を特定するために重要です。
現在、lncRNAの局在は、主に核/細胞質分離アッセイとRNA FISHの2つの方法で検出されています。前者では、細胞質画分と核分画のRNAをそれぞれ抽出し、特定のlncRNAプライマーでPCR増幅を行い、細胞質と核のlncRNAの比率を検出します。この方法の利点は時間効率ですが、欠点は、実際のlncRNAの局在が細胞質と核内のlncRNAの相対的な割合によって直接反映されないことです。RNA FISHは、lncRNA特異的なアンチセンス鎖配列を設計し、それに続く蛍光色素で標識することにより、細胞内のlncRNA局在を検出することができます10。RNA FISH法は、蛍光色素標識マルチオリゴプローブセット11、LNAプローブ12、分岐DNA(bDNA)プローブ13など、プローブ技術および検出法の進歩により改良されてきました。RNA FISHは、lncRNAの局在を検出するだけでなく、ダブルカラーまたはマルチカラーの免疫蛍光法を使用して、他のRNA、DNA、またはタンパク質の共局在を検出することもできます14。
本研究では、骨肉腫細胞(143B)におけるlncRNA低核小体RNA宿主遺伝子6(SNHG6)の詳細な細胞内局在検出プロトコルをRNA FISHに例に含めた。SNHG6は、成熟したスプライシング型の600〜730ヌクレオチドlncRNAであり、結腸直腸癌、胃癌、卵巣明細胞癌、骨肉腫、肝細胞癌など、さまざまなヒト癌における新規癌遺伝子として同定されています15,16,17,18。研究により、SNHG6が増殖、EMT、オートファジーなどのがん細胞の生物学的挙動に関与していることが確認されており、SNHG6の細胞質局在が示されており、miRNAに結合(スポンジ化)することで標的遺伝子に影響を与える可能性があります15,16,17。RNA FISHによるSNHG6細胞内局在のこの詳細な検出プロトコルを本明細書に提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このRNA FISHプロトコルは、セル内のlncRNAの局在を検出するだけでなく、他のRNA、DNA、または細胞内のタンパク質の共局在を検出することもでき、パラフィン包埋組織におけるlncRNAの位置を検出するために使用できます。しかし、そのような場合の特定のプロトコルは、パラフィン包埋組織を脱ワックスする必要があるため、異なる21。この実験手順は、48ウェルまたは96ウェ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、(1)中国国家重点研究開発プログラム(2020YFE0201600)からの助成金によって支援されています。(2)国立自然科学財団(81973877および82174408)。(3)病院TCM準備の産業変革の上海共同イノベーションセンター。(4)上海中医薬大学予算内の研究プロジェクト(2021LK047)。
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
- Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
- Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
- Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
- Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
- Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
- Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
- Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
- Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
- Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
- Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
- Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
- Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
- Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
- Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
- Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
- Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).
