Mevcut protokol, insan osteosarkom hücrelerinde lncRNA’ları lokalize etmek için bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini açıklamaktadır.
Kanser hücrelerinin proliferasyonunu, epitelyal-mezenkimal geçişini (EMT), göçünü, infiltrasyonunu ve otofajisini düzenlemek gibi uzun kodlamayan RNA’ların (lncRNA’lar) kanserdeki önemli rolleri incelenmiştir. Hücrelerdeki lncRNA’ların lokalizasyon tespiti, işlevleri hakkında fikir verebilir. lncRNA’ya özgü antisens zincir dizisini tasarlayarak ve ardından floresan boyalarla etiketleyerek, lncRNA’ların hücresel lokalizasyonunu tespit etmek için RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) uygulanabilir. Mikroskopinin geliştirilmesiyle birlikte, RNA FISH teknikleri artık zayıf ifade edilen lncRNA’ların görselleştirilmesine bile izin veriyor. Bu yöntem sadece tek başına lncRNA’ların lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda çift renkli veya çok renkli immünofloresan kullanarak diğer RNA’ların, DNA’nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir. Burada, insan osteosarkom hücrelerinde (143B) lncRNA küçük nükleolar RNA konak geni 6 (SNHG6) kullanılarak, RNA FISH deneyi yapmak isteyen araştırmacılara, özellikle lncRNA FISH deneyi yapmak isteyen araştırmacılara referans olması açısından RNA FISH’in detaylı deneysel çalışma prosedürü ve önlemlerine örnek olarak yer verdik.
İnsan genomu hakkındaki anlayışımız, tüm genom teknolojisindeki son gelişmelerle büyük ölçüde genişledi. İnsan genomunun yaklaşık% 93’ü RNA’lara kopyalanabilir, ancak RNA’ların sadece% 2’si proteinlere çevrilebilir; protein translasyon işlevi olmayan RNA’ların geri kalan %98’ine kodlamayan RNA (ncRNA)1 denir. Kodlamayan RNA’ların (ncRNA’lar) bir sınıfı olarak, 200’den fazla nükleotid2 içeren uzun ncRNA’lar (lncRNA’lar), hücrelerin farklılaşma, döngü kontrolü, apoptoz, göç ve invazyon gibi birçok fizyolojik ve patolojik sürecine dahil olmaları nedeniyle artan bir ilgi görmüştür 3,4,5. LncRNA’lar, kromatin yapısını ve nükleer gen ekspresyonunu düzenlemek, mRNA ekleme sürecini kontrol etmek ve transkripsiyon sonrası modifikasyon6 gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla rollerini oynarlar. LncRNA’lar, hem transkripsiyonel hem de transkripsiyon sonrası seviyelerde malignitelerin oluşumunu, gelişimini ve metastazını düzenler. Transkripsiyonel regülasyon, kromozomal yapılara bağlanarak RNA transkripsiyonunu etkileyerek çekirdekte gerçekleştirilirken, transkripsiyon sonrası regülasyon, endojen rekabetçi bir RNA (ceRNA) mekanizması 5,7,8 aracılığıyla hedef genlerin kontrol edilmesiyle sitoplazmada gerçekleştirilir. CeRNA, yeni bir RNA etkileşimi mekanizması ortaya çıkardı, yani lncRNA’lar, miRNA’ları adsorbe etmek ve ilgili hedef genlerin miRNA aracılı bozunmasını inhibe etmek için bir sünger görevi görebilir9. Bu nedenle, lncRNA’ların hücre altı lokalizasyonu ile ilgili bilgiler, belirli bir lncRNA’nın sitoplazmada mı yoksa çekirdekte mi bulunduğu, biyolojik işlevlerini tanımlamaya yardımcı olmak için önemlidir.
Şu anda, lncRNA lokalizasyonu esas olarak iki yöntemle tespit edilmektedir, biri nükleus/sitoplazma fraksiyon izolasyon deneyi ve diğeri RNA BALIĞI ile. İlkinde, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlardaki RNA’lar sırasıyla ekstrakte edilir ve daha sonra sitoplazma ve çekirdekteki lncRNA’ların oranını tespit etmek için spesifik lncRNA primerleri ile PCR amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajı zaman verimliliği iken, dezavantajı gerçek lncRNA lokalizasyonunun sitoplazma ve çekirdekteki lncRNA’ların nispi oranı tarafından doğrudan yansıtılmamasıdır. RNA FISH, lncRNA’ya özgü antisens zincir dizilerinin tasarımı ve ardından floresan boyalarla etiketleme yoluyla hücrelerdeki lncRNA lokalizasyonunu tespit edebilir10. RNA FISH yöntemleri, florofor etiketli çoklu oligo prob setleri11, LNA probları12 ve dallanmış DNA (bDNA) probları13 dahil olmak üzere prob teknikleri ve tespit yöntemlerindeki gelişmelerle geliştirilmiştir. RNA FISH sadece lncRNA’nın lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda çift renkli veya çok renkli immünofloresan14 kullanarak diğer RNA’ların, DNA’nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir.
Bu çalışmada, RNA FISH ile osteosarkom hücrelerinde (143B) lncRNA küçük nükleolar RNA konak geni 6’nın (SNHG6) ayrıntılı hücre içi lokalizasyon saptama protokolünü örnek olarak dahil ettik. SNHG6, olgun eklenmiş formunda bir 600-730 nükleotid lncRNA’dır ve kolorektal kanser, mide kanseri, yumurtalık berrak hücreli karsinomu, osteosarkom ve hepatoselüler karsinomdahil olmak üzere çeşitli insan kanserlerinde yeni bir onkogen olarak tanımlanmıştır 15,16,17,18. Çalışmalar, SNHG6’nın proliferasyon, EMT ve otofaji gibi kanser hücrelerinin biyolojik davranışlarına katılımını doğruladı ve SNHG6’nın sitoplazmik lokalizasyonunu, miRNA’ları bağlayarak (süngerleyerek) hedef genleri etkileyebileceğini gösterdi15,16,17. RNA FISH tarafından SNHG6 hücre içi lokalizasyonunun bu ayrıntılı tespit protokolü burada sunulmaktadır.
Bu RNA FISH protokolü, yalnızca hücrelerdeki lncRNA’ların lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda hücrelerdeki diğer RNA’ların, DNA’nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir, bu da parafine gömülü dokulardaki lncRNA’ların yerini tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu gibi durumlarda spesifik protokol farklıdır çünkü parafine gömülü dokuların mumdan arındırılması gerekir21. Bu deneysel prosedür 48 veya 96 oyuklu plakalarda uy…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, (1) Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2020YFE0201600); (2) Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973877 ve 82174408); (3) Şangay Hastane TCM Hazırlığının Endüstriyel Dönüşümü İşbirlikçi İnovasyon Merkezi; (4) Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Bütçesi Kapsamındaki Araştırma Projeleri (2021LK047).
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |