Summary

Knockdown ciblé des gènes du plexus choroïde

Published: June 16, 2023
doi:

Summary

Nous décrivons ici une méthode permettant de modifier sélectivement l’expression des gènes dans le plexus choroïde tout en évitant tout impact dans d’autres zones du cerveau.

Abstract

Le plexus choroïde (ChP) sert de porte d’entrée essentielle pour l’infiltration des cellules immunitaires dans le système nerveux central (SNC) dans des conditions physiologiques et pathologiques. Des recherches récentes ont montré que la régulation de l’activité de la ChP peut offrir une protection contre les troubles du SNC. Cependant, il est difficile d’étudier la fonction biologique de la ChP sans affecter d’autres régions du cerveau en raison de sa structure délicate. Cette étude présente une nouvelle méthode d’inactivation des gènes dans les tissus ChP à l’aide de virus adéno-associés (AAV) ou d’une protéine recombinase de l’enzyme de recombinaison de cyclisation (Cre) constituée de la séquence TAT (CRE-TAT). Les résultats démontrent qu’après l’injection d’AAV ou de CRE-TAT dans le ventricule latéral, la fluorescence était exclusivement concentrée dans le ChP. En utilisant cette approche, l’étude a réussi à faire tomber le récepteur de l’adénosine A 2A (A2A R) dans le ChP en utilisant l’interférence ARN (ARNi) ou Cre/locus des systèmes X-overP1 (Cre/LoxP), et a montré que ce knockdown pourrait atténuer la pathologie de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Cette technique pourrait avoir des implications importantes pour les recherches futures sur le rôle de la ChP dans les troubles du SNC.

Introduction

On a souvent pensé que le plexus choroïde (ChP) aidait à maintenir l’homéostasie fonctionnelle du cerveau en sécrétant du liquide céphalorachidien (LCR) et du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF)1,2. De plus en plus de recherches au cours des trois dernières décennies ont révélé que le ChP représente une voie distincte pour l’infiltration des cellules immunitaires dans le système nerveux central (SNC).

Les jonctions serrées (TJs) de la ChP, composées d’un épithélium ChP monocouche, maintiennent l’homéostasie immunologique en empêchant les macromolécules et les cellules immunitaires de pénétrer dans le cerveau3. Cependant, dans certaines conditions pathologiques, le tissu ChP détecte et réagit aux motifs moléculaires associés au danger (DAMP) dans le LCR et le sang, ce qui entraîne une infiltration immunitaire anormale et un dysfonctionnement cérébral 4,5. Malgré son rôle essentiel, la petite taille de la ChP et son emplacement unique dans le cerveau rendent difficile l’étude de sa fonction sans affecter d’autres régions du cerveau. Par conséquent, la manipulation de l’expression des gènes spécifiquement dans la ChP est une approche idéale pour comprendre sa fonction.

Initialement, les lignées transgéniques de l’enzyme de recombinaison de cyclisation (Cre), qui expriment Cre sous le contrôle de promoteurs spécifiques aux gènes exprimés dans le ChP, étaient couramment utilisées pour supprimer des gènes cibles par croisement avec des gènes candidats floxés 6,7,8. Par exemple, le facteur de transcription Forkhead box J1 (FoxJ1) est exclusivement exprimé dans l’épithélium ChP du cerveau prénatal de la souris7. Ainsi, la lignée FoxJ1-Cre a souvent été utilisée pour supprimer des gènes situés dans le ChP 6,9. Cependant, le succès de cette stratégie repose en grande partie sur la spécificité du promoteur. On a progressivement découvert que le profil d’expression de FoxJ1 n’était pas assez distinctif, car FoxJ1 était également présent dans les cellules épithéliales ciliées dans d’autres parties du cerveau et du système périphérique7. Pour surmonter cette limitation, une injection intra-cérébroventriculaire (ICV) de Cre recombinase a été réalisée pour délivrer la recombinase dans les ventricules des lignées transgéniques floxées. Cette stratégie a montré une spécificité élevée, comme en témoigne la présence de fluorescence tdTomato uniquement dans le tissu ChP10,11. Cependant, cette méthode est encore limitée par la disponibilité de lignées de souris transgéniques floxées. Pour résoudre ce problème, les chercheurs ont utilisé l’injection ICV de virus adéno-associé (AAV) pour obtenir le knockdown spécifique de la ChP ou la surexpression des gènes cibles12,13. Une évaluation complète de différents sérotypes AAV pour l’infection à ChP a révélé que AAV2/5 et AAV2/8 présentent de fortes capacités d’infection dans le ChP, tout en n’infectant pas d’autres régions du cerveau. Cependant, AAV2/8 s’est avéré infecter l’épendyme entourant les ventricules, alors que le groupe AAV2/5 n’a montré aucune infection14. Cette méthode a l’avantage de s’affranchir des limites de l’acquisition d’animaux transgéniques floxés.

Cet article décrit un protocole étape par étape pour l’inactivation des gènes dans la ChP à l’aide de deux méthodes : ICV de l’AAV2/5 portant l’ARNsh du récepteur de l’adénosine A 2A (A 2A R) et la protéine de recombinase Cre constituée de la séquence TAT (CRE-TAT) recombinase pour obtenir une inhibition spécifique de la ChP de A2A R. Les résultats de l’étude suggèrent que l’élimination de A2AR dans le ChP peut atténuer l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Ce protocole détaillé fournit des conseils utiles pour les études de la fonction ChP et l’inactivation spécifique des gènes dans la ChP.

Protocol

Toutes les procédures animales décrites dans cette étude ont été menées conformément aux directives décrites dans le Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Wenzhou. 1. Animaux Achetez des souris mâles C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines et pesant 20 à 22 g. Obtenir la lignée de souris transgénique…

Representative Results

Knockdown A2AR spécifique à la ChP par injection ICV d’AAV2/5-shRNA ou de CRE-TATLe rôle de A2AR dans la ChP en tant que puissant régulateur de l’information neuronale dans la pathogenèse de l’EAE reste incertain. L’inhibition de l’expression A 2A R spécifique de la ChP pourrait fairela lumière sur les effets régulateurs de l’A2AR sur le système immunitaire central dans l’EAE et d’autres inflammations du système nerveux. Cette étu…

Discussion

La recherche a présenté deux approches distinctes pour l’inactivation ciblée des gènes ChP. La première approche a consisté en l’injection ICV de CRE-TAT, qui contient de la Cre recombinase, dans des souris A2ARflox/flox. La deuxième approche a consisté en l’injection d’AAV2/5 dans l’ICV portant l’ARNh de A2AR. En utilisant ces deux stratégies, le travail a permis d’obtenir l’inhibition sélective de A 2A R dans le CHP et a pu démontrer les effets protecteurs de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions chaleureusement la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 31800903, attribuée à W. Zheng) et le projet scientifique et technologique de Wenzhou (n° Y2020426, attribué à Y. Y. Weng) pour leur soutien.

Materials

A2ARflox/flox mice State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD pt-4828
antifade mounting medium Beyotime Biotechnology 0100-01
borosilicate glass capillary Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd B100-50-10
brain stereotaxic apparatus RWD, Shenzhen 69100
C57BL/6 mice Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase Millipore SCR508
DAPI Absin B25A031
frozen slicing machine Leica CM1950
H37Ra Becton Dickinson and company 231141
Hamilton syringe Hamilton, American P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant Sigma F5506
Laser confocal microscope Zeiss LSM900
MOG35-55 Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD 4010006243
OCT glue Epredia 6502p
paraformaldehyde Chengdu Kelong Chemical Reagent Company 30525-89-4
pentobarbital sodium Boyun Biotech PC13003
Pipette gun Eppendorf N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit Takara  6110A
Real- Time PCR System BioRad CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice Jackson Laboratory
sucrose Sangon Biotech A502792-0500
super high speed homogenizer IKA 3737025
Trizol Invitrogen 15596026
xylene solution Chengdu Kelong Chemical Reagent Company 1330-20-7

References

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Cite This Article
Yang, Y., Qi, C., Hu, L., Zheng, C., Li, X., Zheng, W., Weng, Y., Lin, H. Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus. J. Vis. Exp. (196), e65555, doi:10.3791/65555 (2023).

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