Riktad knockdown av gener i plexus choroideus
Summary
Här beskriver vi en metod för att selektivt förändra genuttryck i plexus choroid samtidigt som man undviker påverkan i andra områden i hjärnan.
Abstract
Plexus choroidum (ChP) fungerar som en kritisk inkörsport för immuncellsinfiltration i centrala nervsystemet (CNS) under både fysiologiska och patologiska förhållanden. Ny forskning har visat att reglering av ChP-aktivitet kan ge skydd mot CNS-störningar. Att studera ChP:s biologiska funktion utan att påverka andra hjärnregioner är dock utmanande på grund av dess känsliga struktur. Denna studie presenterar en ny metod för genknockdown i ChP-vävnad med hjälp av adenoassocierade virus (AAV) eller cykliseringsrekombinationsenzym (Cre) rekombinasprotein bestående av TAT-sekvens (CRE-TAT). Resultaten visar att efter injektion av AAV eller CRE-TAT i den laterala ventrikeln var fluorescensen uteslutande koncentrerad i CHP. Med hjälp av detta tillvägagångssätt slog studien framgångsrikt ner adenosin A2A-receptorn (A2AR) i ChP med hjälp av RNA-interferens (RNAi) eller Cre/locus of X-overP1 (Cre/LoxP) system, och visade att denna knockdown kunde lindra patologin för experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE). Denna teknik kan få viktiga implikationer för framtida forskning om CHP:s roll vid CNS-sjukdomar.
Introduction
Plexus choroidus (ChP) ansågs ofta hjälpa till att upprätthålla hjärnans funktionella homeostas genom att utsöndra cerebrospinalvätska (CSF) och hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF)1,2. Ökad forskning under de senaste tre decennierna har visat att ChP representerar en distinkt väg för immuncellsinfiltration i det centrala nervsystemet (CNS).
De täta korsningarna (TJ) i ChP, som består av ett monolager ChP-epitel, upprätthåller immunologisk homeostas genom att förhindra makromolekyler och immunceller från att komma in i hjärnan3. Under vissa patologiska tillstånd detekterar och reagerar ChP-vävnaden dock på faroassocierade molekylära mönster (DAMP) i cerebrospinalvätskan och blodet, vilket leder till onormal immuninfiltration och hjärndysfunktion 4,5. Trots sin avgörande roll gör CHP:s ringa storlek och unika placering i hjärnan det svårt att studera dess funktion utan att påverka andra hjärnregioner. Att manipulera genuttryck specifikt i ChP är därför ett idealiskt tillvägagångssätt för att förstå dess funktion.
Till en början användes transgena linjer med cykliseringsrekombinationsenzym (Cre), som uttrycker Cre under kontroll av promotorer som är specifika för gener som uttrycks i CHP, för att ta bort målgener genom att avla med floxade kandidatgener 6,7,8. Till exempel uttrycks transkriptionsfaktorn Forkhead box J1 (FoxJ1) uteslutande i ChP-epitelet i den prenatala mushjärnan7. Således användes FoxJ1-Cre-linjen ofta för att ta bort gener som finns i ChP 6,9. Framgången för denna strategi beror dock i hög grad på promotorns specificitet. Det upptäcktes gradvis att FoxJ1-uttrycksmönstret inte var tillräckligt utmärkande, eftersom FoxJ1 också fanns i cilierade epitelceller i andra delar av hjärnan och det periferasystemet. För att övervinna denna begränsning utfördes intracerebroventrikulär (ICV) injektion av Cre-rekombinas för att leverera rekombinas in i kamrarna i floxade transgena linjer. Denna strategi uppvisade hög specificitet, vilket framgår av närvaron av tdTomatfluorescens enbart i ChP-vävnaden10,11. Denna metod är dock fortfarande begränsad av tillgången på floxade transgena muslinjer. För att ta itu med detta problem har forskare använt ICV-injektion av adenoassocierat virus (AAV) för att uppnå ChP-specifik knockdown eller överuttryck av målgener12,13. En omfattande utvärdering av olika AAV-serotyper för ChP-infektion visade att AAV2/5 och AAV2/8 uppvisar starka infektionsförmågor i CHP, samtidigt som de inte infekterar andra hjärnregioner. AAV2/8 visade sig dock infektera ependymet som omger ventriklarna, medan AAV2/5-gruppen inte visade någon infektion14. Fördelen med denna metod är att den övervinner begränsningarna med att skaffa floxade transgena djur.
Denna artikel beskriver ett steg-för-steg-protokoll för genknockdown i ChP med hjälp av två metoder: ICV av AAV2/5 som bär shRNA från adenosin A2A-receptorn (A 2A R) och Cre-rekombinasprotein bestående av TAT-sekvens (CRE-TAT) rekombinas för att uppnå ChP-specifik knockdown av A2A R. Studiens resultat tyder på att man genom att slå ner A2AR i CHP kan lindra experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE). Detta detaljerade protokoll ger användbar vägledning för ChP-funktionsstudier och den specifika knockdownen av gener i CHP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskningen presenterade två distinkta tillvägagångssätt för riktad knockdown av ChP-gener. Det första tillvägagångssättet innebar ICV-injektion av CRE-TAT, som innehåller Cre-rekombinas, i A2A Rflox/flox-möss. Den andra metoden innebar ICV-injektion av AAV2/5 som bär shRNA av A2A R. Genom att använda dessa två strategier uppnådde arbetet den selektiva knockdownen av A 2A R inom ChP och kunde visa de skyddande effekterna av att hämma A2AR-signaleringi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för stödet från National Natural Science Foundation of China (anslag nr 31800903, tilldelat W. Zheng) och Wenzhou Science and Technology Project (nr Y2020426, tilldelat Y. Y. Weng) för detta arbete.
Materials
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Myung, J., et al. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
- Zhang, Y., et al. A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).
- Johansson, P. A., et al. The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function. Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).
- Xu, H., et al. Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development. Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).
- Spatazza, J., et al. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
- Zheng, W., et al. Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).
- Steffensen, A. B., et al. Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation. Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).
- Zhu, L., et al. Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).
- Chen, X., et al. Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery. Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).
- Konsman, J. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).
- Weaver, A., et al. An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization. FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Reboldi, A., et al. C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., et al. Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE. Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target. International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).
- Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).
