Her beskriver vi en metode til selektivt at ændre genekspressioner i choroid plexus og samtidig undgå enhver påvirkning i andre hjerneområder.
Choroid plexus (ChP) tjener som en kritisk gateway for immuncelleinfiltration i centralnervesystemet (CNS) under både fysiologiske og patologiske tilstande. Nyere forskning har vist, at regulering af ChP-aktivitet kan tilbyde beskyttelse mod CNS-lidelser. Imidlertid er det udfordrende at studere den biologiske funktion af ChP uden at påvirke andre hjerneområder på grund af dens sarte struktur. Denne undersøgelse præsenterer en ny metode til genknockdown i ChP-væv ved hjælp af adeno-associerede vira (AAV’er) eller cykliseringsrekombinationsenzym (Cre) rekombinaseprotein bestående af TAT-sekvens (CRE-TAT). Resultaterne viser, at fluorescensen efter injektion af AAV eller CRE-TAT i den laterale ventrikel udelukkende var koncentreret i ChP. Ved hjælp af denne tilgang slog undersøgelsen med succes adenosin A 2A-receptoren (A2A R) ned i ChP ved hjælp af RNA-interferens (RNAi) eller Cre / locus af X-overP1 (Cre / LoxP) systemer og viste, at denne knockdown kunne lindre patologien for eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE). Denne teknik kan have vigtige konsekvenser for fremtidig forskning i ChP’s rolle i CNS-lidelser.
Choroid plexus (ChP) blev ofte anset for at hjælpe med at opretholde hjernens funktionelle homeostase ved at udskille cerebrospinalvæske (CSF) og hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF)1,2. Stigende forskning i løbet af de sidste tre årtier har afsløret, at ChP repræsenterer en særskilt vej til immuncelleinfiltration i centralnervesystemet (CNS).
De tætte kryds (TJ’er) af ChP, der består af et monolags ChP-epitel, opretholder immunologisk homeostase ved at forhindre makromolekyler og immunceller i at komme ind i hjernen3. Under visse patologiske tilstande registrerer og reagerer ChP-vævet imidlertid på fareassocierede molekylære mønstre (DAMP’er) i CSF og blod, hvilket fører til unormal immuninfiltration og hjernedysfunktion 4,5. På trods af sin kritiske rolle gør ChP’s lille størrelse og unikke placering i hjernen det vanskeligt at studere dens funktion uden at påvirke andre hjerneområder. Derfor er manipulation af genekspression specifikt i ChP en ideel tilgang til at forstå dens funktion.
Indledningsvis blev cykliseringsrekombinationsenzym (Cre) transgene linjer, som udtrykker Cre under kontrol af promotorer, der er specifikke for gener udtrykt i ChP, almindeligt anvendt til at slette målgener ved avl med floxede kandidatgener 6,7,8. For eksempel udtrykkes transkriptionsfaktoren Gaffelhovedboks J1 (FoxJ1) udelukkende i ChP-epitelet i den prænatale musehjerne7. Således blev FoxJ1-Cre-linjen ofte brugt til at slette gener placeret i ChP 6,9. Denne strategis succes afhænger imidlertid i høj grad af initiativtagerens specificitet. Det blev gradvist opdaget, at FoxJ1-ekspressionsmønsteret ikke var karakteristisk nok, da FoxJ1 også var til stede i cilierede epitelceller i andre dele af hjernen og det perifere system7. For at overvinde denne begrænsning blev intracerebroventrikulær (ICV) injektion af Cre rekombinase udført for at levere rekombinase i ventriklerne i floxede transgene linjer. Denne strategi viste høj specificitet, hvilket fremgår af tilstedeværelsen af tdTomatfluorescens udelukkende i ChP-vævet10,11. Denne metode er dog stadig begrænset af tilgængeligheden af floxed transgene muselinjer. For at løse dette problem har forskere anvendt ICV-injektion af adeno-associeret virus (AAV) for at opnå ChP-specifik knockdown eller overekspression af målgener12,13. En omfattende evaluering af forskellige AAV-serotyper for ChP-infektion afslørede, at AAV2/5 og AAV2/8 udviser stærke infektionsevner i ChP, mens de ikke inficerer andre hjerneområder. AAV2/8 viste sig imidlertid at inficere ependyma omkring ventrikler, mens AAV2/5-gruppen ikke viste nogen infektion14. Denne metode har den fordel, at den overvinder begrænsningerne ved at erhverve floxed transgene dyr.
Denne artikel beskriver en trin-for-trin protokol for gen-knockdown i ChP ved hjælp af to metoder: ICV af AAV2/5, der bærer shRNA af adenosin A 2A-receptoren (A 2A R) og Cre-rekombinaseprotein bestående af TAT-sekvens (CRE-TAT) rekombinase for at opnå ChP-specifik knockdown af A2A R. Undersøgelsesresultaterne tyder på, at knocking ned A2AR i ChP kan lindre eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE). Denne detaljerede protokol giver nyttig vejledning til ChP-funktionsundersøgelser og den specifikke knockdown af gener i ChP.
Forskningen præsenterede to forskellige tilgange til målrettet knockdown af ChP-gener. Den første fremgangsmåde involverede ICV-injektion af CRE-TAT, som indeholder Cre-rekombinase, i A2AR-floks/flox-mus. Den anden fremgangsmåde indebar ICV-injektion af AAV2/5, der bærer shRNA af A2AR. Ved at udnytte disse to strategier opnåede arbejdet den selektive knockdown af A 2A R inden for ChP og var i stand til at demonstrere de beskyttende virkninger af at hæmme A2AR-signalerin…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender taknemmeligt støtten fra National Natural Science Foundation of China (bevilling nr. 31800903, tildelt W. Zheng) og Wenzhou Science and Technology Project (nr. Y2020426, tildelt Y. Y. Weng) til dette arbejde.
A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
DAPI | Absin | B25A031 | |
frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
OCT glue | Epredia | 6502p | |
paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |