Snelle in-vitrocytotoxiciteitsevaluatie van Jurkat die chimere antigeenreceptor tot expressie brengt met behulp van fluorescerende beeldvorming
Summary
Een protocol om kwantitatieve tumorceldoding te evalueren door Jurkat-cellen die chimere antigeenreceptor (CAR) tot expressie brengen die gericht zijn op een enkel tumorantigeen. Dit protocol kan worden gebruikt als een screeningsplatform voor snelle optimalisatie van CAR-scharnierconstructies voorafgaand aan bevestiging in perifere bloed-afgeleide T-cellen.
Abstract
Chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen lopen voorop in de oncologie. Een CAR is opgebouwd uit een targetingdomein (meestal een variabel fragment met één keten, scFv), met een bijbehorende intra-chain linker, gevolgd door een scharnier-, transmembraan- en costimulatoirdomein. Modificatie van het intra-chain linker- en scharnierdomein kan een significant effect hebben op CAR-gemedieerde doding. Gezien de vele verschillende opties voor elk onderdeel van een CAR-constructie, zijn er grote aantallen permutaties. Het maken van CAR-T-cellen is een tijdrovend en duur proces, en het maken en testen van veel constructies is een zware investering in tijd en materiaal. Dit protocol beschrijft een platform om snel scharnier-geoptimaliseerde CAR-constructies in Jurkat-cellen (CAR-J) te evalueren. Jurkat-cellen zijn een onsterfelijke T-cellijn met een hoge lentivirusopname, waardoor efficiënte CAR-transductie mogelijk is. Hier presenteren we een platform om CAR-J snel te evalueren met behulp van een fluorescerende imager, gevolgd door bevestiging van cytolyse in PBMC-afgeleide T-cellen.
Introduction
CAR-T-celtherapie is veelbelovend gebleken bij hematologische maligniteiten, zoals blijkt uit de 6 door de FDA goedgekeurde CAR-T-producten sinds 2017, zoals gerapporteerd door het National Cancer Institute1. Er zijn talloze CAR-T-cellen in klinische onderzoeken voor het aanpakken van solide tumoren. Het ontwikkelen van nieuwe CAR-doelen en het optimaliseren van het CAR-construct is van vitaal belang voor de werkzaamheid van een CAR-T-cel. Het kiezen van de ideale CAR-constructie voor elke toepassing is essentieel voor het nauwkeurig richten van tumorgeassocieerde antigenen (TAA) en het vermijden van lage niveaus van TAA-expressie in normale weefsels.
Een CAR-construct bestaat voornamelijk uit vijf compartimenten: (1) extracellulair enkelvoudig variabel fragment (scFv)-domein gericht op tumorantigeen; (2) scharnier domein; (3) transmembraan domein; (4) intracellulair cytoplasmatisch T-cel costimulatoir domein; en (5) signaleringsdomein. Het wijzigen van elk van deze domeinen beïnvloedt de precisie van de CAR-T-cel die in contact komt met zijn doelcel3. Daarom is het van cruciaal belang om de cytotoxiciteit en kruisreactiviteit van deze CAR-constructen in vitro te evalueren om het juiste construct te kiezen om door te gaan naar in vivo experimenten. De huidige methoden voor het evalueren van cytolyse door T-cellen omvatten 51Cr-afgiftetest, lactaatdehydrogenase-afgiftetest, bioluminescente beeldvormingstest, real-time impedantie-gebaseerde celanalyse en celgebaseerde flowcytometrie-assay 4,5. Het fluorescerende beeldvormingsplatform dat hier wordt beschreven, identificeert het aantal levende versus dode cellen, wat een directe kwantificering is van de cytolyse van T-cellen, in tegenstelling tot een indirecte methode om de cytolyse door T-cellen te evalueren.
Hier is een eenvoudige, kostenefficiënte, snelle en hoge doorvoertechniek met minimale interventie om de cytotoxiciteit te evalueren van Jurkat-cellen die epidermale groeifactorreceptor (EGFR) CAR tot expressie brengen tegen MDA-MB-231 triple-negatieve borstkankercellen (TNBC) en EGFR CRISPR knock-out MDA-MB-231-cellen. Jurkat-cellen zijn onsterfelijke menselijke T-lymfocytcellen6 die op grote schaal zijn gebruikt voor het bestuderen van T-celactiverings- en signaleringsmechanismen7. Bovendien zijn Jurkat-cellen gebruikt voor in vitro CAR-testen in meerdere onderzoeken 8,9,10,11. Jurkat-cellen worden gemakkelijk getransduceerd door lentivirus en hebben aanhoudende proliferatie, en dit systeem werd gebruikt om het scharnierdomein van verschillende EGFR CAR-constructies te optimaliseren.
Deze test kan worden gebruikt voor het screenen van meerdere CAR-constructen gericht op verschillende tumorantigenen en kan worden gebruikt tegen meerdere aanhangende tumorcellijnen en in verschillende effector-tot-tumor (E:T)-verhoudingen. Bovendien kunnen meerdere tijdstippen worden geëvalueerd en kan het aantal replicaten worden aangepast om de beste moord onder de verschillende CAR-constructies te identificeren. De beste constructen moeten worden bevestigd met behulp van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) die afkomstig zijn van CD3 T-cellen. Het algemene doel achter de ontwikkeling van deze methode is om de CAR-scharniergeometrie snel te optimaliseren op een manier met een hoge doorvoer, waarbij barrières zoals een lage transductie-efficiëntie worden overwonnen, gevolgd door bevestiging in PBMC-afgeleide T-cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we een snelle methode voorgesteld om de doelspecifieke cytolytische activiteit geïnduceerd door CAR-expressie in Jurkat-cellen efficiënt te evalueren. Alle CAR-constructen hebben dezelfde scFv, maar verschillende scharnier- en transmembraandomeinen waarvan is aangetoond dat ze de potentie van CAR-T-cellen beïnvloeden13. Verdere evaluatie van niet-specifieke doding door deze CAR-J werd gedaan door ze te kweken met antigeen knock-out (KO) cellen. Dit toont aan dat het doden tumorantig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231 was een vriendelijk geschenk van Dr. Shane Stecklein. De auteurs erkennen financiering van het University of Kansas Cancer Center om dit onderzoek uit te voeren.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. . Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- . Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023)
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
