En protokoll for å evaluere kvantitativ tumorcelledrap av Jurkat-celler som uttrykker kimær antigenreseptor (CAR) rettet mot enkelttumorantigen. Denne protokollen kan brukes som en screeningplattform for rask optimalisering av CAR-hengselkonstruksjoner før bekreftelse i perifere blodavledede T-celler.
Chimeric antigen receptor (CAR) T-celler er i forkant av onkologi. En CAR er konstruert av et målrettingsdomene (vanligvis et enkelt kjedevariabelfragment, scFv), med en tilhørende intrakjedekobling, etterfulgt av et hengsel, transmembran og kostimulerende domene. Modifikasjon av intra-chain linker og hengseldomene kan ha en betydelig effekt på CAR-mediert drap. Tatt i betraktning de mange forskjellige alternativene for hver del av en CAR-konstruksjon, er det et stort antall permutasjoner. Å lage CAR-T-celler er en tidkrevende og kostbar prosess, og å lage og teste mange konstruksjoner er en tung tids- og materialinvestering. Denne protokollen beskriver en plattform for raskt å evaluere hengseloptimaliserte CAR-konstruksjoner i Jurkat-celler (CAR-J). Jurkat-celler er en udødeliggjort T-cellelinje med høyt lentivirusopptak, noe som muliggjør effektiv CAR-transduksjon. Her presenterer vi en plattform for rask evaluering av CAR-J ved hjelp av et fluorescerende bildeapparat, etterfulgt av bekreftelse av cytolyse i PBMC-avledede T-celler.
CAR-T-celleterapi har vist stort løfte om hematologiske maligniteter, tydelig fra de 6 FDA-godkjente CAR-T-produktene siden 2017, som rapportert av National Cancer Institute1. Det er mange CAR-T-celler i kliniske studier for å målrette solide svulster. Utvikling av nye CAR-mål og optimalisering av CAR-konstruksjonen er avgjørende for effektiviteten til en CAR-T-celle. Å velge den ideelle CAR-konstruksjonen for hver applikasjon er avgjørende for nøyaktig målretting av tumorassosierte antigener (TAA), samtidig som man unngår lave nivåer av TAA-uttrykk i normalt vev2.
En CAR-konstruksjon er hovedsakelig laget av fem rom: (1) ekstracellulært enkeltkjede variabelt fragment (scFv) domene rettet mot tumorantigen; (2) hengsel domene; (3) transmembran domene; (4) intracellulært cytoplasmatisk T-celle costimulatorisk domene; og (5) signaldomene. Endring av hvert av disse domenene påvirker presisjonen til CAR-T-cellen som engasjerer seg i målcellen3. Derfor er evaluering av cytotoksisiteten og kryssreaktiviteten til disse CAR-konstruksjonene in vitro avgjørende for å velge riktig konstruksjon for å komme videre mot in vivo-eksperimenter. Nåværende metoder for evaluering av cytolyse av T-celler inkluderer 51Cr release assay, laktat dehydrogenase release assay, bioluminescerende imaging assay, real-time impedansbasert celleanalyse og cellebasert flowcytometrianalyse 4,5. Den fluorescerende bildebaserte plattformen beskrevet her identifiserer antall levende vs. døde celler, som er en direkte kvantifisering av T-cellecytolyse i motsetning til en indirekte metode for å evaluere cytolyse av T-celler.
Her er en enkel, kostnadseffektiv, rask og høy gjennomstrømningsteknikk med minimal intervensjon for å evaluere cytotoksisiteten til Jurkat-celler som uttrykker epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) CAR mot MDA-MB-231 trippel-negativ brystkreft (TNBC) celler og EGFR CRISPR slår ut MDA-MB-231-celler. Jurkatceller er udødeliggjorte humane T-lymfocyttceller6 som har blitt mye brukt til å studere T-celleaktivering og signalmekanismer7. Videre har Jurkat-celler blitt brukt til in vitro CAR-testing i flere studier 8,9,10,11. Jurkat-celler blir lett transdusert av lentivirus og har vedvarende spredning, og dette systemet ble utnyttet for å optimalisere hengseldomenet til forskjellige EGFR CAR-konstruksjoner.
Denne analysen kan brukes til screening av flere CAR-konstruksjoner rettet mot forskjellige tumorantigener og brukes mot flere adherente tumorcellelinjer og i forskjellige effektor til tumor (E: T) forhold. I tillegg kan flere tidspunkter evalueres, og antall replikater kan endres for å identifisere beste drap blant de forskjellige CAR-konstruksjonene. De beste konstruksjonene må bekreftes ved bruk av mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) avledet CD3 T-celler. Det overordnede målet bak utviklingen av denne metoden er å raskt optimalisere CAR-hengselgeometrien på en høy gjennomstrømningsmåte som overvinner barrierer som lav transduksjonseffektivitet, etterfulgt av bekreftelse i PBMC-avledede T-celler.
Her har vi foreslått en rask metode for effektivt å evaluere den målspesifikke cytolytiske aktiviteten indusert av CAR-ekspresjon i Jurkat-celler. Alle CAR-konstruksjoner har samme scFv, men forskjellige hengsel- og transmembrandomener som har vist seg å påvirke CAR-T-cellers styrke13. Videre evaluering av uspesifikke drap av disse CAR-J ble gjort ved å dyrke dem med antigen knock out (KO) celler. Dette viser at drapet er tumorantigenspesifikt og ikke skyldes basal aktivering av CAR-J. Cytot…
The authors have nothing to disclose.
MDA-MB-231 var en snill gave fra Dr. Shane Stecklein. Forfatterne anerkjenner finansiering fra University of Kansas Cancer Center for å gjennomføre denne forskningen.
15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |