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Biology

एंजियोजेनेसिस अध्ययन के लिए विवो मैट्रिक्स जेल प्लग परख में संशोधित

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65567
Automatic Translation
*1,2, *2, *2, *2, *2, 2, 1, 1,2, 1,2
1Pingyang Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 2School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत विधि धुंधला हो जाने के बिना विवो में एंजियोजेनेसिस या संवहनी पारगम्यता पर अभिकर्मकों के प्रभाव का मूल्यांकन कर सकती है। विधि नव-वाहिकाओं या संवहनी रिसाव की कल्पना करने के लिए पूंछ नस के माध्यम से डेक्सट्रान-एफआईटीसी इंजेक्शन का उपयोग करती है।

Abstract

विवो में एंजियोजेनेसिस की जांच के लिए कई मॉडल विकसित किए गए हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश मॉडल जटिल और महंगे हैं, विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, या बाद के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए प्रदर्शन करना कठिन होता है। यहां हम विवो में एंजियोजेनेसिस का मूल्यांकन करने के लिए एक संशोधित मैट्रिक्स जेल प्लग परख प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, संवहनी कोशिकाओं को प्रो-एंजियोजेनिक या एंटी-एंजियोजेनिक अभिकर्मकों की उपस्थिति या अनुपस्थिति में मैट्रिक्स जेल के साथ मिलाया गया था, और फिर प्राप्तकर्ता चूहों के पीछे चमड़े के नीचे इंजेक्शन दिया गया था। 7 दिनों के बाद, डेक्सट्रान-एफआईटीसी युक्त फॉस्फेट बफर खारा पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है और 30 मिनट के लिए जहाजों में प्रसारित किया जाता है। मैट्रिक्स जेल प्लग एकत्र कर रहे हैं और ऊतक एम्बेडिंग जेल के साथ एम्बेडेड हैं, तो 12 माइक्रोन वर्गों धुंधला बिना प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए कटौती कर रहे हैं. इस परख में, उच्च आणविक भार (~ 150,000 दा) के साथ डेक्सट्रान-एफआईटीसी का उपयोग उनकी लंबाई का पता लगाने के लिए कार्यात्मक जहाजों को इंगित करने के लिए किया जा सकता है, जबकि कम आणविक भार (~ 4,400 दा) के साथ डेक्सट्रान-एफआईटीसी का उपयोग नव-जहाजों की पारगम्यता को इंगित करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल विवो में एंजियोजेनेसिस के मात्रात्मक अध्ययन के लिए एक विश्वसनीय और सुविधाजनक तरीका प्रदान कर सकता है।

Introduction

एंजियोजेनेसिस, पहले से मौजूद जहाजों से नव-वाहिकाओं के गठन की प्रक्रिया, कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जैसे कि भ्रूण विकास, घाव भरने, एथेरोस्क्लेरोसिस, ट्यूमर विकास, आदि1,2,3,4,5। इस गतिशील प्रक्रिया में कई कदम शामिल हैं, जिसमें मैट्रिक्स का क्षरण, संवहनी कोशिका प्रसार, प्रवास और स्व-संगठन ट्यूबलर संरचनाएं बनाने और नव-वाहिकाओं के स्थिरीकरण सहितशामिल हैं 6. एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देने को मायोकार्डियल रोधगलन, स्ट्रोक और इस्केमिक रोगों के अन्य प्रकार के उपचार में महत्वपूर्ण होने के लिए प्रदर्शित किया गया है7 जबकि एंजियोजेनेसिस को रोकना कैंसर8 और संधिशोथरोगों 9 के उपचार में एक आशाजनक रणनीति माना गया है। एंजियोजेनेसिस को दवाकी खोज 10 के लिए एक आयोजन सिद्धांत माना गया है। इस प्रकार, एंजियोजेनेसिस की सीमा का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय और सुविधाजनक विधि का निर्माण एंजियोजेनेसिस-निर्भर रोगों में यांत्रिक अनुसंधान या दवा की खोज के लिए महत्वपूर्ण है।

एंजियोजेनेसिस11 का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो और इन विवो मॉडल में कई विकसित किए गए हैं। इनमें से, दो-आयामी (2-डी) मॉडल, जैसे मैट्रिक्स जेल ट्यूब गठन परख12, कार्यात्मक ट्यूबलर संरचनाएं नहीं बना सकते हैं। इस तरह के हिंद अंग इस्किमिया मॉडल13,14 के रूप में पशु मॉडल, एंजियोजेनेसिस प्रक्रिया को पुन: पेश कर सकते हैं, लेकिन जटिल हैं और एक लेजर धब्बेदार रक्त प्रवाह इमेजिंग प्रणाली की आवश्यकता होती है. मैट्रिक्स जेल प्लग परख की तरह संवहनी morphogenesis के 3 डी मॉडल, विवो15 में एंजियोजेनेसिस की प्रक्रिया की नकल कर सकते हैं कि एक सरल मंच प्रदान करते हैं, लेकिन एंजियोजेनेसिस का पता लगाने immunohistochemistry या immunofluorescenceधुंधला 16,17,18, जो चर और खराब कल्पना कर रहे हैं की आवश्यकता है.

यहां, हम एक संशोधित मैट्रिक्स जेल प्लग परख के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जहां संवहनी कोशिकाओं को मैट्रिक्स जेल के साथ मिलाया गया था और प्लग बनाने के लिए चूहों के पीछे चमड़े के नीचे इंजेक्शन दिया गया था। प्लग में, संवहनी कोशिकाओं को आंतरिक वातावरण में रक्त प्रवाह के साथ कार्यात्मक वाहिकाओं को बनाने के लिए मैट्रिक्स को नीचा दिखाने, प्रसार करने, प्रवास करने और आत्म-व्यवस्थित करने की आवश्यकता होती है। इसके बाद, फ्लोरोसेंट-लेबल वाले डेक्सट्रान को प्लग के माध्यम से प्रवाह करने के लिए पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है, और लेबल को नव-वाहिकाओं को इंगित करने के लिए कल्पना की जाती है। एंजियोजेनेसिस की सामग्री का मात्रात्मक रूप से जहाजों की लंबाई से मूल्यांकन किया जा सकता है। यह विधि कार्यात्मक जहाजों है कि 2 डी एंजियोजेनेसिस मॉडल12 में उत्पादन नहीं किया जा सकता फार्म कर सकते हैं, और साधारण मैट्रिक्स जेल प्लग परख11 में के रूप में जटिल दाग प्रक्रिया की जरूरत नहीं है. यह भी हिंद अंग इस्किमिया मॉडल 13,14,19 में लेजर धब्बेदार रक्त प्रवाह इमेजिंग प्रणाली की तरह महंगे विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता नहीं है. यह विधि बहुमुखी, कम लागत वाली, मात्रात्मक और प्रदर्शन करने में आसान है, और इसका उपयोग दवाओं के समर्थक या एंटी-एंजियोजेनिक क्षमता को निर्धारित करने या एंजियोजेनेसिस में शामिल यांत्रिक अनुसंधान में उपयोग करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

पशु विषयों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को वानजाउ मेडिकल यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था (XMSQ2021-0057, 19जुलाई, 2021)। सभी अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों को सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किया गया है।

1. संस्कृति माध्यम तैयारी

  1. 10x M199 संस्कृति माध्यम: M199 पाउडर को 90 एमएल विआयनीकृत पानी के साथ 10x एकाग्रता में भंग करें और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 10 एमएल जोड़ें, फिर 0.22 माइक्रोन फिल्टर से गुजरें। 2 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम स्टोर करें।
  2. पूर्ण एंडोथेलियल कल्चर माध्यम: एंडोथेलियल सेल माध्यम (ईसीएम) के 460 एमएल में एफबीएस के 50 एमएल, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 एमएल और एंडोथेलियल सेल ग्रोथ सप्लीमेंट के 5 एमएल जोड़ें। 1 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यम स्टोर करें।

2. संवहनी कोशिका तैयारी

  1. संस्कृति 1 x 105 संवहनी कोशिकाएं (प्राथमिक सुसंस्कृत एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाएं14, एंडोथेलियल कोशिकाएं, या एंडोथेलियल सेल लाइनें) 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 से 70% संगम पर 100 मिमी टिशू कल्चर डिश में पूर्ण एंडोथेलियल कल्चर माध्यम के 8 एमएल के साथ।
  2. संस्कृति माध्यम निकालें और अनासक्त कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ पकवान 2x कुल्ला। पीबीएस निकालें और 2.21 मिमी EDTA युक्त 0.25% trypsin के 3 एमएल जोड़ें, और 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. पूर्ण एंडोथेलियल संस्कृति माध्यम के 7 एमएल के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें, और धीरे से संस्कृति पकवान से कोशिकाओं को कुल्ला। एक प्रकाश खुर्दबीन (40x बढ़ाई) के तहत सेल टुकड़ी की पुष्टि करें।
  4. 15 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन और 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र लीजिए। सतह पर तैरनेवाला निकालें और पूर्ण endothelial संस्कृति माध्यम के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  5. एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और निलंबन को 2 x 106 कोशिकाओं वाले बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में ले जाएं। प्रत्येक प्लग में 1.5 x 106 सेल होते हैं, कचरे के मामले में अतिरिक्त 25% सेल का उपयोग किया जाता है। प्रत्येक समूह में कम से कम 3 प्लग शामिल हैं।
    नोट: परीक्षणों के बाद यह पाया गया कि मैट्रिक्स जेल के 300 माइक्रोन में 1.5 x 106 कोशिकाओं ने एंजियोजेनेसिस के उचित विकास का नेतृत्व किया और इसलिए प्रयोग के लिए चुना गया।
  6. गोली कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन, और फिर सतह पर तैरनेवाला हटा दें।

3. मैट्रिक्स जेल की तैयारी

  1. प्री-कूल बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब जिसमें 4 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेल गोली होती है। प्री-कूल 30G 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में 1 एमएल इंसुलिन सीरिंज।
  2. पूरी तरह से एक 4 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मैट्रिक्स जेल पिघलना। मिश्रण या भंवर न करें। प्री-कूल 10x M199 और 4 °C पानी के स्नान में अभिकर्मक/ड्रग-ऑफ-इंटरेस्ट का परीक्षण करें।
  3. 10% एफबीएस युक्त 10x M199 के साथ प्री-कूल्ड मैट्रिक्स जेल मिलाएं और मैट्रिक्स जेल और 1% एफबीएस और अभिकर्मक युक्त M199 मिश्रण प्राप्त करने के लिए 8.8: 1: 0.2 के वॉल्यूम अनुपात पर परीक्षण किया जाना है।
  4. मैट्रिक्स जेल मिश्रण के 400 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, बुलबुले बनाने से बचने के लिए धीरे से मिलाएं। बर्फ पर ट्यूब रखें जब तक चूहों इंजेक्शन के लिए तैयार कर रहे हैं. जमावट से बचने के लिए हर समय बर्फ पर मैट्रिक्स जेल मिश्रण रखें।
    नोट: यहां, 1.5 x 106 कोशिकाओं वाले मैट्रिक्स जेल मिश्रण के 300 माइक्रोन का उपयोग जेल प्लग बनाने के लिए किया गया था। चरण 2 में 25% अतिरिक्त कोशिकाओं के अनुसार 25% अतिरिक्त जेल तैयार करें।

4. माउस तैयारी

  1. isoflurane के साथ पशु संज्ञाहरण डिवाइस के कक्ष में 6-8 सप्ताह पुराने पुरुष Nu/Nu माउस (18-25 ग्राम) एनेस्थेटाइज करें (1 L/मिनट के प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में 3% isoflurane)। सफल संवेदनाहारी के बाद, सही पलटा और पैर की अंगुली चुटकी पलटा की अनुपस्थिति से पुष्टि की, कक्ष के बाहर माउस कदम, कक्ष के बाहर माउस ले जाने और माउस पर एक संज्ञाहरण मुखौटा डाल दिया और 1 एल / मिनट के प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में isoflurane की एकाग्रता 1.5% करने के लिए बदल जाते हैं.
    नोट: प्रक्रिया के दौरान एक हीटिंग पैड का उपयोग कर पशु को थर्मल समर्थन प्रदान करें.
  2. सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें। प्रवण स्थिति में ऑपरेशन बोर्ड पर चूहों के अंगों को टेप करें।

5. मैट्रिक्स जेल मिश्रण इंजेक्शन

  1. एक 30 जी सुई के साथ एक 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज में मैट्रिक्स जेल मिश्रण के 300 माइक्रोन लोड. बुलबुला गठन से बचें। जल्दी से इस समय के दौरान जमने से बचने के लिए मैट्रिक्स जेल (2 मिनट के भीतर) लोड. मैट्रिक्स जेल से भरी इंसुलिन सिरिंज को तुरंत बर्फ पर रखें।
  2. 75% अल्कोहल पैड का उपयोग करके चूहों की पीठ पर त्वचा को साफ करें। चमड़े के नीचे चूहों की पीठ के एक तरफ मैट्रिक्स जेल मिश्रण के 300 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
  3. धीरे मैट्रिक्स जेल मिश्रण के रिसाव को रोकने के लिए इंजेक्शन साइट से सुई को हटा दें। इंजेक्शन साइट (चित्रा 1) पर एक छोटे से कूबड़ के लिए जाँच करें.
  4. मैट्रिक्स जेल मिश्रण जमावट और फार्म प्लग जाने के लिए 2 मिनट के लिए हीटिंग पैड पर माउस रखें.
  5. 5.2 कदम दोहराएँ. 5.4 करने के लिए। माउस के पीछे के दूसरी तरफ प्लग बनाने के लिए। मार्कर पेन का उपयोग करके कूबड़ के किनारों को चिह्नित करें।
  6. माउस का निरीक्षण करें जब तक कि वह स्टर्नल रिकम्बेंसी को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। माउस को एक अलग पिंजरे में रखें जब तक कि यह पूरी तरह से ठीक न हो जाए। 7 दिनों के लिए एक 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ 22 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर एसपीएफ़ वर्ग प्रयोगात्मक पशु प्रयोगशाला में चूहों हाउस.

6. पूंछ नस के माध्यम से डेक्सट्रान-एफआईटीसी इंजेक्शन

  1. मैट्रिक्स जेल इंजेक्शन के 7 दिनों के बाद, डबल आसुत जल (डीडीएच2ओ) के 500 माइक्रोन के साथ 0.5 मिलीग्राम डेक्सट्रान-एफआईटीसी को फिर से निलंबित करें और फिर 1 माइक्रोग्राम/जेडएल की अंतिम एकाग्रता पर डेक्सट्रान-एफआईटीसी समाधान प्राप्त करने के लिए हिंसक भंवर।
    नोट: एंजियोजेनेसिस परख के लिए ~ 150 केडीए के आणविक भार के साथ डेक्सट्रान-एफआईटीसी का उपयोग करें, और संवहनी पारगम्यता परख के लिए ~ 4 केडीए के आणविक भार के साथ डेक्सट्रान-एफआईटीसी का उपयोग करें।
  2. 29G सीरिंज में डेक्सट्रान-FITC समाधान के 50 माइक्रोन लोड करें।
  3. पूंछ नस इंजेक्शन साधन पर माउस को ठीक करें. 75% अल्कोहल कपास की गेंद के साथ पूंछ को साफ करें और धीरे से पूंछ नस के माध्यम से डेक्सट्रान-एफआईटीसी के 50 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
  4. रक्तस्राव को रोकने के लिए 1 मिनट के लिए कपास झाड़ू के साथ इंजेक्शन साइट को संपीड़ित करें, और फिर चूहों को 30 मिनट के लिए पिंजरे में वापस रख दें।
  5. 6.3 कदम दोहराएँ. और 6.4। जब तक सभी चूहों को डेक्सट्रान-एफआईटीसी इंजेक्शन नहीं मिला है।

7. मैट्रिक्स जेल प्लग संग्रह

  1. इंट्रापेरिटोनली पीबीएस (200 मिलीग्राम/किग्रा शरीर के वजन) में 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम इंजेक्ट करें और आईएसीयूसी अनुमोदित प्रक्रिया के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दें।
  2. सर्जिकल कैंची का उपयोग करके प्लग की चिह्नित सीमा के साथ त्वचा को काटें और मैट्रिक्स जेल प्लग के ऊपर की त्वचा को हटा दें।
  3. प्लग लीजिए और अतिरिक्त रक्त (चित्रा 2 ए) को धोने के लिए 1x पीबीएस के साथ एक छोटे बीकर में कुल्ला। प्लग का रंग मोटे तौर पर रक्त बहुतायत की डिग्री और नव-वाहिकाओं (चित्रा 3ए)की सामग्री को चित्रित कर सकता है।

8. एम्बेडिंग मैट्रिक्स जेल प्लग और अनुभाग तैयारी

  1. ऊतक एम्बेडिंग जेल के लगभग 0.5 एमएल के साथ ऊतक एम्बेडिंग कैसेट के बटन को कवर करें, फिर तुरंत चित्रा 2 बी में दिखाए गए अनुसार वांछित अभिविन्यास में ऊतक एम्बेडिंग जेल पर मैट्रिक्स जेल प्लग रखें। फिर, अतिरिक्त ऊतक एम्बेडिंग जेल के साथ प्लग एम्बेड करें।
  2. जमने के लिए 12 घंटे के लिए कैसेट को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
  3. मोटी खंड की तैयारी के लिए, ठोस प्लग ब्लॉक को बाहर निकालें और निर्देश के अनुसार ठंड माइक्रोटोम का उपयोग करके 12 माइक्रोन मोटी वर्गों को काट लें, और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट करें।
  4. प्रत्येक प्लग ब्लॉक से 5-10 वर्गों टुकड़ा.

9. एंजियोजेनेसिस की मात्रा का ठहराव (चित्र 3)

  1. 10x आवर्धन के तहत 488 एनएम तरंग दैर्ध्य पर एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ अनुभाग के 5 स्वतंत्र क्षेत्रों से प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करें।
  2. छवि J सॉफ़्टवेयर (https://imagej.en.softonic.com/) के साथ छवि फ़ाइल खोलें और एंजियोजेनेसिस विश्लेषण बटन पर क्लिक करें। फिर, HUVEC चरण कंट्रास्ट का विश्लेषण करें बटन पर क्लिक करें, और जानकारी एकत्र करने के लिए स्टेट परिणाम तालिका पर स्विच करें। प्रत्येक अनुभाग के लिए सभी 5 अधिग्रहीत प्रतिदीप्ति छवियों को मापें।
  3. इन समूहों के बीच एंजियोजेनेसिस में अंतर का सांख्यिकीय मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न समूहों से नव-जहाजों की कुल लंबाई का विश्लेषण करें।
    नोट: कुल मास्टर सेगमेंट लंबाई नव-जहाजों की कुल लंबाई को इंगित करता है। अभिकर्मक जो नव-वाहिकाओं की लंबाई बढ़ाता है उसे प्रो-एंजियोजेनिक कहा जाता है, जबकि अभिकर्मक जो नव-वाहिकाओं की लंबाई को कम करता है वह एंटी-एंजियोजेनिक होता है।

10. संवहनी पारगम्यता की मात्रा का ठहराव (चित्रा 4)

  1. 20x आवर्धन के तहत 488 एनएम तरंग दैर्ध्य पर एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ अनुभाग के 5 स्वतंत्र क्षेत्रों से प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करें।
  2. छवि खोलें file छवि J सॉफ़्टवेयर के साथ। फ्रीहैंड चयन बटन पर क्लिक करें और रिसाव क्षेत्र को सर्कल करें, फिर विश्लेषण मेनू पर क्लिक करें और रिसाव क्षेत्र की क्षेत्र की जानकारी प्राप्त करने के लिए माप विकल्प चुनें। संवहनी पारगम्यता को इंगित करने के लिए रिसाव क्षेत्र और छवि के क्षेत्र के अनुपात का उपयोग करें।
  3. इन समूहों के बीच संवहनी पारगम्यता में अंतर का सांख्यिकीय मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न समूहों से रिसाव क्षेत्र और छवि के क्षेत्र के अनुपात का विश्लेषण करें।

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Representative Results

चित्रा 1 फ़्लोचार्ट है जो दर्शाता है कि मैट्रिक्स जेल, संवहनी कोशिकाओं, संस्कृति माध्यम और अभिकर्मक के मिश्रण को कैसे तैयार किया जाए। मिश्रण तो subcutaneously नू चूहों के पीछे में इंजेक्ट किया गया था और अंत में जेल प्लग फार्म करने के लिए अपने जमावट में तेजी लाने के लिए एक हीटिंग पैड का उपयोग गर्म किया गया था.

चित्रा 2 ए फ्लोरोसेंट लेबल डेक्सट्रान के साथ जहाजों को इंगित करने के लिए फ़्लोचार्ट है। फ्लोरोसेंट लेबल डेक्सट्रान को पूंछ नस और सर्कल के माध्यम से 30 मिनट के लिए इंजेक्ट किया गया था, इसलिए यह जेल प्लग में कार्यात्मक पोत में प्रवेश कर सकता है। इसके बाद, जेल प्लग एकत्र किए गए थे, ऊतक एम्बेडिंग जेल (मैट्रिक्स जेल का अभिविन्यास जब एम्बेडेड चित्रा 2 बी में इंगित किया गया था) का उपयोग करके एम्बेडेड किया गया था। मोटी खंड का एक 12 माइक्रोन प्लग (प्रत्येक तरफ से 5 स्लाइस) से कटा हुआ था और फ्लोरोसेंट चित्रों एंजियोजेनेसिस और / या संवहनी पारगम्यता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए लिया गया था.

चित्रा 3 जेल प्लग में एंजियोजेनेसिस पर एंटी-एंजियोजेनिक अभिकर्मक पामिटेट और प्रो-एंजियोजेनिक अभिकर्मक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 1 (एफजीएफ 1) का प्रभाव है। चित्रा 3 ए वाहन, पामिटेट या एफजीएफ 1 के साथ जेल प्लग की उपस्थिति है। रक्त जेल प्लग में कार्यात्मक नव-पोत में प्रवेश कर सकता है, जो प्लग को अलग-अलग डिग्री तक लाल बनाता है। चित्रा 3 बी मैट्रिक्स जेल प्लग की फ्लोरोसेंट छवि है, जिसमें कार्यात्मक जहाजों को उच्च आणविक भार के साथ डेक्सट्रान-एफआईटीसी द्वारा कल्पना की गई थी। चित्रा 3 सी विभिन्न समूह की पोत लंबाई का मात्रात्मक परिणाम है। पामिटेट नव-वाहिकाओं की लंबाई को काफी कम कर सकता है, जबकि एफजीएफ 1 उपचार स्पष्ट रूप से लंबाई बढ़ा सकता है।

चित्रा 4 संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) उपचार के साथ या बिना जेल प्लग में संवहनी पारगम्यता की तुलना करता है। चित्रा 4 ए मैट्रिक्स जेल प्लग की फ्लोरोसेंट छवि है, जिसमें रिसाव क्षेत्र को कम आणविक भार के साथ डेक्सट्रान-एफआईटीसी द्वारा कल्पना की जाती है और तीर द्वारा इंगित किया जाता है। चित्रा 4 बी रिसाव क्षेत्र का मात्रात्मक परिणाम है। वीईजीएफ उपचार समूह में बढ़े हुए रिसाव क्षेत्र से पता चला कि वीईजीएफ संवहनी पारगम्यता बढ़ा सकता है।

Figure 1
चित्र 1. फ्लोचार्ट चूहों में एक जेल प्लग के गठन को दर्शाता है। मोनोलेयर कल्चर में सुसंस्कृत संवहनी कोशिकाओं को एंडोथेलियल सेल माध्यम (ईसीएम) के साथ अलग, पेलेटेड, पुन: निलंबित किया जाता है, और गिना जाता है (I-IV)। मैट्रिक्स जेल मिश्रण में पेलेटिंग और रिसस्पेंशन के बाद (8.8 वॉल्यूम मैट्रिक्स जेल युक्त, 1 वॉल्यूम 10x M199 10% एफबीएस और 0.2 वॉल्यूम अभिकर्मक के साथ पूरक), जेल मिश्रण के 300 माइक्रोन को प्लग बनाने के लिए चूहों (वी-VII) के पीछे चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. फ्लोचार्ट डेक्सट्रान-एफआईटीसी इंजेक्शन और एंजियोजेनेसिस की मात्रा का ठहराव दिखा रहा है। (ए) डेक्सट्रान-एफआईटीसी को पूंछ नस (आई) के माध्यम से इंजेक्ट किया गया था। 30 मिनट के बाद, जेल प्लग का अधिग्रहण किया गया था, एम्बेडेड और वर्गों ठंड microtome (द्वितीय, तृतीय) का उपयोग कटा हुआ था. इसके बाद, प्रतिदीप्ति छवियों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चतुर्थ) का उपयोग कर लिया गया और एंजियोजेनेसिस मात्रात्मक छवि जे सॉफ्टवेयर (वी) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था. (बी) मैट्रिक्स जेल प्लग अभिविन्यास का आरेख जब ऊतक एम्बेडिंग कैसेट में एम्बेडेड होता है। संक्षिप्ताक्षर: OCT = इष्टतम काटने का तापमान यौगिक। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. संशोधित मैट्रिक्स जेल प्लग परख का उपयोग कर एंजियोजेनेसिस का मूल्यांकन। (ए) प्रतिनिधि मैट्रिक्स जेल प्लग की उपस्थिति। (बी)डेक्सट्रान-एफआईटीसी द्वारा इंगित मैट्रिक्स जेल प्लग में कार्यात्मक जहाजों की फ्लोरोसेंट तस्वीर। (सी) एक तरफा एनोवा का उपयोग करके मैट्रिक्स जेल प्लग में कार्यात्मक जहाजों की लंबाई का मात्रात्मक विश्लेषण। *पी<0.05 बनाम वाहन; पी<0.001 बनाम वाहन। स्केल बार 100 माइक्रोन है। संक्षिप्ताक्षर: FGF1 = फाइब्रोब्लास्ट वृद्धि कारक 1। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4. संशोधित मैट्रिक्स जेल प्लग परख का उपयोग कर संवहनी पारगम्यता का मूल्यांकन. (ए)जेल प्लग में जहाजों की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवि, तीर रिसाव स्थल का संकेत देते हैं। (बी) छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके संवहनी पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए रिसाव क्षेत्र का मात्रात्मक विश्लेषण। पी<0.001. स्केल बार 100 माइक्रोन है। संक्षिप्ताक्षर: VEGF = संवहनी एंडोथेलियल वृद्धि कारक। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम धुंधला हो जाना बिना विवो में एंजियोजेनेसिस के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय और सुविधाजनक तरीका प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, संवहनी कोशिकाओं को प्रो-एंजियोजेनिक या एंटी-एंजियोजेनिक अभिकर्मकों की उपस्थिति में मैट्रिक्स जेल के साथ मिलाया गया था, और फिर जेल प्लग(चित्रा 1)बनाने के लिए एनयू/एनयू चूहों के पीछे चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया था। जेल प्लग गठन के 7 दिनों के बाद, डेक्सट्रान-एफआईटीसी को अंतःशिरा इंजेक्शन दिया गया और 30 मिनट के लिए प्रसारित किया गया। जेल प्लग एकत्र किया गया था और ऊतक एम्बेडिंग जेल के साथ एम्बेडेड था, और 12 माइक्रोन वर्गों को फोटोग्राफी(चित्रा 2)के लिए कटा हुआ था। डेक्सट्रान-एफआईटीसी धुंधला होने के बिना कार्यात्मक जहाजों को इंगित कर सकता है, और नव-जहाजों की लंबाई का उपयोग अभिकर्मकों के प्रो-एंजियोजेनिक या एंटी-एंजियोजेनिक फ़ंक्शन का मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत उदाहरण में, पामिटेट उपचार ने नव-जहाजों की लंबाई कम कर दी, जबकि एफजीएफ 1 ने नव-जहाजों (चित्रा 3) की लंबाई में वृद्धि की, जिसने संकेत दिया कि पामिटेट एंटी-एंजियोजेनिक है, जबकि एफजीएफ 1 प्रो-एंजियोजेनिक है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी संवहनी पारगम्यता (चित्रा 4) के मूल्यांकन में इस्तेमाल किया जा सकता है.

प्राप्तकर्ता चूहों के चयन, मैट्रिक्स जेल को संभालने और इंजेक्शन लगाने, जेल प्लग इकट्ठा करने और जहाजों की लंबाई का पता लगाने पर सावधानी बरतनी चाहिए। 6-8 सप्ताह की आयु के इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों की सिफारिश की जाती है, हालांकि C57BL/6 चूहे भी काम करने योग्य हैं। प्लग में परिवर्तनशीलता को ध्यान में रखते हुए, प्रत्येक समूह में 3-5 प्लग की सिफारिश की जाती है। संवहनी कोशिकाओं की संख्या विभिन्न समूहों के बीच भी होनी चाहिए। मैट्रिक्स जेल को निर्देशों के अनुसार सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए और इसका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए यदि जम या कण पदार्थ या कई बुलबुले हों। मैट्रिक्स जेल तैयारी कदम में, मैट्रिक्स जेल की अंतिम एकाग्रता 80% से कम नहीं होनी चाहिए, और भंवर की अनुमति नहीं है क्योंकि बुलबुले बन सकते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जेल प्लग का आकार परिणामों की प्रजनन क्षमता को प्रभावित कर सकता है, इसलिए मैट्रिक्स जेल प्लग के ठोसकरण में तेजी लाने के लिए हीटिंग पैड का उपयोग किया गया था। एक 37 डिग्री सेल्सियस पशु इनक्यूबेटर भी इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, जेल प्लग एम्बेडिंग और अनुभाग तैयार करने के दौरान, प्लग और वर्गों को उज्ज्वल प्रकाश के खिलाफ संरक्षित किया जाना चाहिए, और जितनी जल्दी हो सके एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत तस्वीरें ली जानी चाहिए।

विवो एंजियोजेनेसिस परख में विभिन्न के बीच, मैट्रिक्स जेल प्लग परख सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है क्योंकि यह बहुमुखी, कम खर्चीला, और11 प्रदर्शन करने में आसान है। हालांकि, साधारण मैट्रिक्स जेल प्लग परख में धुंधला प्रक्रिया त्रुटि प्रवण है। प्लग नाजुक है और उच्च पानी की मात्रा के साथ है। धुंधला प्रक्रिया में शामिल निर्जलीकरण और निर्धारण कदम जेल प्लग को विकृत कर सकते हैं, और जहाजों की लंबाई के मूल्यांकन को और प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, प्लग में बिखरे हुए संवहनी कोशिकाओं को दाग दिया जा सकता है और साधारण मैट्रिक्स जेल प्लग परख में कार्यात्मक जहाजों के रूप में पहचाना जा सकता है। इस संशोधित मैट्रिक्स जेल प्लग परख के सबसे महत्वपूर्ण लाभों में से एक यह है कि कार्यात्मक जहाजों को धुंधला किए बिना कल्पना की जा सकती है। FITC-लेबल वाले डेक्सट्रान का उपयोग जहाजों को इंगित करने के लिए किया गया था, और केवल कार्यात्मक जहाजों जिनमें रक्त प्रवाह होता है, का संकेत दिया जा सकता है, जो इस परख की सुविधा और विश्वसनीयता में योगदान देता है।

नव-जहाजों की लंबाई के अलावा, पारगम्यता नव-जहाजों20 के कार्य को भी प्रभावित करती है। कम आणविक भार (~ 4,400 दा) के साथ फ्लोरोसेंट-लेबल डेक्सट्रान जहाजों में अंतर से गुजर सकता है और इसका उपयोग नव-जहाजों की पारगम्यता को इंगित करने के लिए किया जा सकता है। यदि आवश्यक हो, तो शोधकर्ता कम आणविक भार के साथ फ्लोरोसेंट-लेबल डेक्सट्रान और उच्च आणविक भार21 के साथ दोनों का उपयोग करके एक ही जेल प्लग में एंजियोजेनेसिस और संवहनी पारगम्यता दोनों का मूल्यांकन कर सकते हैं।

एंजियोजेनेसिस इन विवो वातावरण 22 से प्रभावित हो सकता है, जैसे मधुमेह 13,14,19, आदि। यह विवो वातावरण में इन इन विट्रो मॉडल में पुन: पेश करना कठिन है। हालांकि, इस संशोधित प्रोटोकॉल में, विवो वातावरण में आसानी से उचित प्राप्तकर्ता चूहों का चयन करके पुन: पेश किया जा सकता है. इसके अलावा, विभिन्न संवहनी कोशिकाओं के बीच बातचीत भी एंजियोजेनेसिस की प्रक्रिया को प्रभावित करती है। एंडोथेलियल कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और पेरिसाइट्स सहित विभिन्न प्रकार की संवहनी कोशिकाओं को एंजियोजेनेसिस में विभिन्न संवहनी कोशिकाओं के योगदान की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल में प्लग में नव-जहाजों को बनाने के लिए जोड़ा जा सकता है।

हालाँकि, इस पद्धति की कुछ सीमाएँ भी हैं। नव-वाहिकाओं का गठन जेल प्लग के आकार से प्रभावित हो सकता है। इसके अलावा, जेल प्लग में गठित नव-वाहिकाएं भी नहीं हैं। केंद्र में जेल प्लग के किनारे पर अधिक कार्यात्मक जहाजों (चित्रा 2 ए) हैं। इस प्रकार, परिणाम कलाकार की प्रवीणता से प्रभावित हो सकते हैं।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया (LY22H020005), और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81873466).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesion Microscope Slides CITOTEST 188105
Anesthesia System RWD R640-S1
Cell Counter Invitrogen AMQAX1000
Cell Culture Dish Corning 430167
Cryoslicer Thermo Fisher CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa WEIHUA BIO WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa WEIHUA BIO WH007N0705
Embedding Cassettes CITOTEST 80203-0007
Endothelial Cell Medium ScienCell 35809
Endothelial Growth Supplements ScienCell 1025
Fetal Bovine Serum Gibco 10100147C
Fibroblast Growth Factor 1 AtaGenix 9043p-082318-A01 FGF1
Fluorescence Microscope Nikon ECLIPSE Ni
Heating Pad Boruida 30-50-30
Insulin Syringe BD 300841
Isoflurane RWD R510-22-10
Laboratory Balance Sartorius BSA124S-CW
Matrigel Corning 356234 Matrix gel
Medium 199 powder Gibco 31100-035
Microtubes Axygen MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound SUKURA 4583 Tissue embedding gel
Palmitate Acid KunChuang KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid Solarbio P1400
Phosphate Buffer Saline Solarbio P1022
Surgical Instruments RWD RWD
Tail Vein Injection Instrument KEW BASIS KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution Solarbio T1320
Ultra-Low Temperature Freezer eppendorf U410
Vascular Endothelial Growth Factor CHAMOT CM058-5HP VEGF

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References

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एंजियोजेनेसिस विवो में मैट्रिक्स जेल प्लग परख संवहनी कोशिकाएं प्रो-एंजियोजेनिक एंटी-एंजियोजेनिक चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्राप्तकर्ता चूहों फॉस्फेट बफर खारा डेक्सट्रान-एफआईटीसी कार्यात्मक वाहिकाओं नव-वाहिकाओं प्रतिदीप्ति का पता लगाने मात्रात्मक विश्लेषण
एंजियोजेनेसिस अध्ययन <em>के लिए विवो</em> मैट्रिक्स जेल प्लग परख में संशोधित
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Lu, Z., Yi, M., Chen, T., He, Y., Fan, X., Chen, H., Huang, Y., Niu, J., Yan, X. Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies. J. Vis. Exp. (196), e65567, doi:10.3791/65567 (2023).

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