Fenotypisk profilering av humane stamcellederiverte midbrain dopaminerge nevroner

Summary

Denne protokollen beskriver celledyrking av humane midbrain dopaminerge nevroner, etterfulgt av immunologisk farging og generering av neuronale fenotypiske profiler fra ervervede mikroskopiske bilder med høyt innhold som tillater identifisering av fenotypiske variasjoner på grunn av genetiske eller kjemiske modulasjoner.

Abstract

Parkinsons sykdom (PD) er knyttet til en rekke cellebiologiske prosesser som forårsaker midbrain dopaminerge (mDA) nevrontap. Mange nåværende in vitro PD-cellulære modeller mangler kompleksitet og tar ikke hensyn til flere fenotyper. Fenotypisk profilering i humane induserte pluripotente stamceller (iPSC)-avledede mDA-nevroner kan adressere disse manglene ved samtidig å måle en rekke nevrale fenotyper i en PD-relevant celletype parallelt. Her beskriver vi en protokoll for å oppnå og analysere fenotypiske profiler fra kommersielt tilgjengelige humane mDA-nevroner. Et nevronspesifikt fluorescerende fargepanel brukes til å visualisere kjernefysiske, α-synuclein, tyrosinhydroksylase (TH) og mikrotubuli-assosiert protein 2 (MAP2) relaterte fenotyper. Den beskrevne fenotypiske profileringsprotokollen er skalerbar da den bruker 384-brønnplater, automatisk væskehåndtering og mikroskopi med høy gjennomstrømning. Nytten av protokollen eksemplifiseres ved bruk av friske donor mDA-nevroner og mDA-nevroner som bærer den PD-koblede G2019S-mutasjonen i Leucin-rik gjentatt kinase 2 (LRRK2) genet. Begge cellelinjene ble behandlet med LRRK2-kinasehemmeren PFE-360 og fenotypiske forandringer ble målt. I tillegg demonstrerer vi hvordan flerdimensjonale fenotypiske profiler kan analyseres ved hjelp av clustering eller maskinlæringsdrevne overvåkede klassifiseringsmetoder. Den beskrevne protokollen vil spesielt interessere forskere som arbeider med modellering av nevronsykdom eller studerer kjemiske sammensatte effekter i humane nevroner.

Introduction

En rekke cellebiologiske prosesser forstyrres i Parkinsons sykdom (PD). For eksempel har mitokondriell dysfunksjon, oksidativt stress, proteinnedbrytningsdefekter, forstyrrelse av vesikulær trafikk og endolysosomal funksjon vært assosiert med midbrain dopaminerge (mDA) nevrontap, er ofte observert i PD¹. Derfor ser PD ut til å involvere flere sykdomsmekanismer som kan samhandle med og forverre hverandre. En nyttig måte å undersøke dette mekanistiske samspillet på er å lage et omfattende fenotypisk fingeravtrykk eller profil av midbrain dopaminerge (mDA) nevroner.

Fenotypisk profilering er en tilnærming som innebærer å lage en profil av en prøve basert på en samling av målbare egenskaper, og for det andre innebærer det å gjøre spådommer om et utvalg basert på denne profilen ^2,3. Målet med profilering er å fange opp et mangfoldig utvalg av funksjoner, hvorav noen kanskje ikke tidligere har vært forbundet med en sykdom eller behandling³. Som et resultat kan profilering avsløre uventede biologiske prosesser. Fenotypisk profilering er vanligvis avhengig av fluorescerende fargede celler, og standardiserte analyser, for eksempel Cell Painting, er utviklet for å lage fenotypiske profiler⁴. Nylig har fenotypisk profilering for eksempel blitt brukt til karakterisering av små molekyler eller nøyaktig prediksjon av PD-subtyper utelukkende basert på pasientavledede fibroblaster ^5,6. Til tross for disse fremskrittene har fenotypisk profilering sjelden blitt brukt på postmitotiske differensierte celler, slik som humane induserte pluripotente stamceller (iPSC)-avledede mDA-nevroner som uttrykker PD-koblede mutasjoner som LRRK2 G2019S. Betydelige utfordringer med iPSC-avledede modeller inkluderer tilstedeværelsen av subtile eller variable patologiske trekk på tvers av differensieringspartier eller genotyper, og det faktum at isolerte PD-fenotyper ikke fanger opp sykdommens fulle kompleksitet. Videre, mens iPSC nevronmodeller er fysiologisk relevante, blir de sjelden brukt i PD-oppdagelsesprosesser på grunn av bekymringer om teknisk kompleksitet ^7,8.

Vi har tidligere utviklet en robust metodikk for å måle flere PD-relaterte patofysiologiske fenotyper i humane mDA-nevroner som både er følsomme for genetiske og kjemiske forbindelsesinduserte fenotypiske endringer⁹. Denne artikkelen beskriver i detalj en ytterligere optimalisert versjon av denne metoden for å lage fenotypiske profiler fra mDA-nevroner (figur 1). Denne protokollen har flere fordeler i forhold til de tidligere beskrevne fenotypiske profileringsmetodene, for eksempel bruk av høykvalitets mDA-nevroner og teknisk reproduserbarhet. For første gang muliggjør denne protokollen fenotypisk profilering i fysiologisk relevante postmitotiske mDA-nevroner etter kjemiske forstyrrelser på en svært skalerbar måte. Fullt differensierte og kryopreserverte mDA-nevroner er kommersielt tilgjengelige, noe som reduserer batch-til-batch-differensieringsvariabiliteten betydelig. For det andre kan teknisk variabilitet reduseres ytterligere ved å bruke et veldefinert eksperimentelt design (dvs. kulturvarighet eller unngå kantbrønner), automatisert væskehåndtering og automatisert mikroskopi. I tillegg er de første trinnene i fenotypisk profilanalyse ved hjelp av ikke-overvåket klynging eller veiledede klassifiseringstilnærminger skissert her, noe som indikerer hvordan fenotypiske profileringsdata kan analyseres. Denne protokollen vil være til nytte for forskere som er interessert i fenotypiske endringer av mDA-nevroner indusert av genetiske eller kjemiske forstyrrelser, spesielt når et svært skalerbart studieoppsett kreves, for eksempel under screeningskampanjer eller når effekten av et mindre antall forbindelser skal studeres, for eksempel for å bestemme toksiske effekter. Oppsummert forventes det at anvendelsen av fenotypisk profilering av humane nevroner er en verdifull teknikk for å studere komplekse sykdomsrelaterte fenotyper og karakterisere de cellulære effektene av legemiddelkandidater.

Figur 1: Skjematisk fremstilling av eksperimentell protokoll for å generere bildebaserte fenotypiske profiler fra humane iPSC-deriverte mDA-nevroner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Fremstilling av medium og plater for nevronsåing (dag 1) For å forberede platene for nevronsåing på dag 1, varm Laminin til romtemperatur (RT) like før bruk. Tilbered Lamininoppløsningen ved å fortynne Laminin-oppløsningen (0,1 mg/ml) 1/10 i kald PBS+/+ (med Ca 2+ og Mg2+).MERK: Alle reagenser er oppført i materialfortegnelsen. Sammensetning av løsninger og buffere er beskrevet i tabell 1-4. Deretter tilsettes 25…

Representative Results

Fenotypisk profilering i mDA-nevroner er en effektiv måte å kvantifisere flere aspekter av cellulær biologi og deres endringer under den eksperimentelle modulasjonen. For å eksemplifisere denne metodikken brukte denne studien kryopreservert LRRK2 G2019S og friske donor mDA-nevroner. Disse nevronene har blitt differensiert i ca. 37 dager, er postmitotiske og ekspressnevronale markører (TUBB3 og MAP2) og dopaminerge nevronmarkører, inkludert tyrosinhydroksylase (TH) i kombinasjon med FOXA2, mens gliamarkøren Glial F…

Discussion

Fenotypisk profilering er en teknikk for å måle et stort antall fenotyper i celler ved å bruke fluorescerende farginger, mikroskopi og bildeanalyse³. Fenotypiske profiler kan oppnås og sammenlignes på tvers av cellelinjer eller andre eksperimentelle forhold for å forstå komplekse endringer i cellulær biologi som kan gå ubemerket hen når du bruker en enkelt avlesning. Her beskriver vi anvendelsen av fenotypisk profilering på humane iPSC-avledede mDA-nevroner, en celletype som ofte brukes…

Materials

Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse – Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit – Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.