Fenotypisk profilering av humana stamcellshärledda dopaminerga neuroner i mellanhjärnan

Summary

Detta protokoll beskriver cellodling av humana dopaminerga neuroner i mellanhjärnan, följt av immunologisk färgning och generering av neuronala fenotypiska profiler från förvärvade mikroskopiska bilder med högt innehåll som möjliggör identifiering av fenotypiska variationer på grund av genetiska eller kemiska modulationer.

Abstract

Parkinsons sjukdom (PD) är kopplad till en rad cellbiologiska processer som orsakar förlust av neuroner i mellanhjärnan (mDA). Många nuvarande in vitro PD-cellulära modeller saknar komplexitet och tar inte hänsyn till flera fenotyper. Fenotypisk profilering i humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda mDA-neuroner kan åtgärda dessa brister genom att samtidigt mäta en rad neuronala fenotyper i en PD-relevant celltyp parallellt. Här beskriver vi ett protokoll för att erhålla och analysera fenotypiska profiler från kommersiellt tillgängliga humana mDA-neuroner. En neuronspecifik fluorescerande färgningspanel används för att visualisera de nukleära, α-synuklein, tyrosinhydroxylas (TH) och mikrotubuliassocierat protein 2 (MAP2) relaterade fenotyperna. Det beskrivna fenotypiska profileringsprotokollet är skalbart eftersom det använder 384-brunnars plattor, automatisk vätskehantering och mikroskopi med hög genomströmning. Nyttan av protokollet exemplifieras med hjälp av friska mDA-neuroner från donatorer och mDA-neuroner som bär på den PD-länkade G2019S-mutationen i genen Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2). Båda cellinjerna behandlades med LRRK2-kinashämmaren PFE-360 och fenotypiska förändringar mättes. Dessutom visar vi hur flerdimensionella fenotypiska profiler kan analyseras med hjälp av klustring eller maskininlärningsdrivna övervakade klassificeringsmetoder. Det beskrivna protokollet kommer särskilt att intressera forskare som arbetar med modellering av neuronala sjukdomar eller studerar kemiska sammansatta effekter i mänskliga neuroner.

Introduction

En mängd olika cellbiologiska processer störs vid Parkinsons sjukdom (PD). Till exempel har mitokondriell dysfunktion, oxidativ stress, proteinnedbrytningsdefekter, störning av vesikulär trafik och endolysosomal funktion associerats med förlust av neuroner i mellanhjärnan (mDA), som vanligtvis observeras vid PD¹. Därför verkar PD involvera flera sjukdomsmekanismer som kan interagera med och förvärra varandra. Ett användbart sätt att undersöka detta mekanistiska samspel är att skapa ett omfattande fenotypiskt fingeravtryck eller profil av mitthjärnans dopaminerga (mDA) neuroner.

Fenotypisk profilering är ett tillvägagångssätt som innebär att man skapar en profil av ett prov baserat på en samling mätbara egenskaper, och för det andra innebär det att man gör förutsägelser om ett prov baserat på denna profil ^2,3. Målet med profilering är att fånga ett brett spektrum av egenskaper, av vilka några kanske inte tidigare har förknippats med en sjukdom eller behandling³. Som ett resultat kan profilering avslöja oväntade biologiska processer. Fenotypisk profilering förlitar sig vanligtvis på fluorescerande färgade celler, och standardiserade analyser, såsom cellmålning, har utvecklats för att skapa fenotypiska profiler⁴. På senare tid har fenotypisk profilering till exempel tillämpats för karakterisering av små molekyler eller noggrann förutsägelse av PD-subtyper enbart baserat på fibroblaster från patienter ^5,6. Trots dessa framsteg har fenotypisk profilering sällan tillämpats på postmitotiska differentierade celler, såsom humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda mDA-neuroner som uttrycker PD-kopplade mutationer såsom LRRK2 G2019S. Betydande utmaningar med iPSC-härledda modeller inkluderar förekomsten av subtila eller variabla patologiska egenskaper över differentieringssatser eller genotyper, och det faktum att isolerade PD-fenotyper inte fångar sjukdomens fulla komplexitet. Dessutom, även om iPSC-neuronala modeller är fysiologiskt relevanta, används de sällan i PD-läkemedelsupptäcktsprocesser på grund av oro för teknisk komplexitet ^7,8.

Vi har tidigare utvecklat en robust metodik för att mäta flera PD-relaterade patofysiologiska fenotyper i humana mDA-neuroner som både är känsliga för genetiska och kemiska föreningsinducerade fenotypiska förändringar⁹. Den här artikeln beskriver i detalj en ytterligare optimerad version av denna metod för att skapa fenotypiska profiler från mDA-neuroner (figur 1). Detta protokoll har flera fördelar jämfört med de tidigare beskrivna fenotypiska profileringsmetoderna, såsom användningen av högkvalitativa mDA-neuroner och teknisk reproducerbarhet. För första gången möjliggör detta protokoll fenotypisk profilering i fysiologiskt relevanta postmitotiska mDA-neuroner efter kemiska störningar på ett mycket skalbart sätt. Fullt differentierade och kryokonserverade mDA-neuroner är kommersiellt tillgängliga, vilket avsevärt minskar differentieringsvariabiliteten mellan batcher. För det andra kan den tekniska variabiliteten minskas ytterligare genom att använda en väldefinierad experimentell design (dvs. odlingstid eller undvikande av kantbrunnar), automatiserad vätskehantering och automatiserad mikroskopi. Dessutom beskrivs de inledande stegen i fenotypisk profilanalys med hjälp av oövervakad klustring eller övervakade klassificeringsmetoder här, vilket indikerar hur fenotypiska profileringsdata kan analyseras. Detta protokoll kommer att vara användbart för forskare som är intresserade av fenotypiska förändringar av mDA-neuroner inducerade av genetiska eller kemiska störningar, särskilt när en mycket skalbar studieuppställning krävs, till exempel under screeningkampanjer eller när effekterna av ett mindre antal föreningar ska studeras, till exempel för att bestämma toxiska effekter. Sammanfattningsvis förväntas tillämpningen av fenotypisk profilering av humana nervceller vara en värdefull teknik för att studera komplexa sjukdomsrelaterade fenotyper och karakterisera de cellulära effekterna av läkemedelskandidater.

Figur 1: Schematisk skildring av det experimentella protokollet för att generera bildbaserade fenotypiska profiler från humana iPSC-härledda mDA-neuroner. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

1. Beredning av medium och plattor för neuronsådd (dag 1) För att förbereda plattorna för neuronsådd på dag-1, värm Laminin till rumstemperatur (RT) strax före användning. Bered lamininlösningen genom att späda stamlösningen laminin (0,1 mg/ml) 1/10 i kallt PBS+/+ (med Ca 2+ och Mg2+).OBS: Alla reagenser är listade i materialtabellen. Sammansättningen av lösningar och buffertar beskrivs i tabellerna 1-4. Tills…

Representative Results

Fenotypisk profilering i mDA-neuroner är ett effektivt sätt att kvantifiera flera aspekter av cellbiologi och deras förändringar under den experimentella moduleringen. För att exemplifiera denna metodik använde denna studie kryokonserverade LRRK2 G2019S och friska mDA-neuroner från donatorer. Dessa nervceller har differentierats i cirka 37 dagar, är postmitotiska och uttrycker neuronala markörer (TUBB3 och MAP2) och dopaminerga neuronmarkörer, inklusive tyrosinhydroxylas (TH) i kombination med FOXA2, medan glia…

Discussion

Fenotypisk profilering är en teknik för att mäta ett stort antal fenotyper i celler genom att tillämpa fluorescerande färgningar, mikroskopi och bildanalys³. Fenotypiska profiler kan erhållas och jämföras över cellinjer eller andra experimentella förhållanden för att förstå komplexa förändringar i cellbiologi som kan gå obemärkt förbi när man använder en enda avläsning. Här beskriver vi tillämpningen av fenotypisk profilering på humana iPSC-härledda mDA-neuroner, en cellt…

Materials

Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse – Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit – Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.