JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

Published: July 14, 2023
doi:
10.3791/65573
, , ,
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University

Summary

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Abstract

Conventionele botregeneratietherapie met mesenchymale stamcellen (MSC’s) is moeilijk toe te passen op botdefecten die groter zijn dan de kritische grootte, omdat het geen mechanisme heeft om angiogenese te induceren. Het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel vervaardigd uit MSC’s induceert angiogenese en botvorming in vivo via endochondrale ossificatie (ECO). Daarom kan deze ECO-gemedieerde benadering in de toekomst een veelbelovende botregeneratietherapie zijn. Een belangrijk aspect van de klinische toepassing van deze ECO-gemedieerde benadering is het opstellen van een protocol voor het voorbereiden van voldoende kraakbeen om te worden geïmplanteerd om het botdefect te herstellen. Het is vooral niet praktisch om een enkele massa getransplanteerd kraakbeen te ontwerpen van een grootte die overeenkomt met de vorm van het eigenlijke botdefect. Daarom moet het te transplanteren kraakbeen de eigenschap hebben om integraal bot te vormen wanneer meerdere stukken worden geïmplanteerd. Hydrogels kunnen een aantrekkelijk hulpmiddel zijn voor het opschalen van weefselgemanipuleerde transplantaten voor endochondrale ossificatie om aan klinische vereisten te voldoen. Hoewel veel natuurlijk afgeleide hydrogels de vorming van MSC-kraakbeen in vitro en ECO in vivo ondersteunen, moet het optimale steigermateriaal om aan de behoeften van klinische toepassingen te voldoen nog worden bepaald. Hyaluronzuur (HA) is een cruciaal onderdeel van de extracellulaire matrix van het kraakbeen en is een biologisch afbreekbaar en biocompatibel polysacharide. Hier laten we zien dat HA-hydrogels uitstekende eigenschappen hebben om in vitro differentiatie van MSC-gebaseerd kraakbeenweefsel te ondersteunen en de endochondrale botvorming in vivo te bevorderen.

Introduction

Autoloog bot is nog steeds de gouden standaard voor het repareren van botdefecten als gevolg van trauma, aangeboren afwijkingen en chirurgische resectie. Autogene bottransplantatie heeft echter aanzienlijke beperkingen, waaronder donorpijn, risico op infectie en beperkt botvolume dat kan worden geïsoleerd van de patiënten 1,2,3,4. Er zijn tal van biomaterialen ontwikkeld als botvervangers, waarbij natuurlijke of synthetische polymeren worden gecombineerd met gemineraliseerde materialen zoals calciumfosfaat of hydroxyapatiet 5,6. Botvorming in deze gemanipuleerde materialen wordt meestal bereikt met behulp van het gemineraliseerde materiaal als priming-materiaal om stamcellen rechtstreeks te laten differentiëren in osteoblasten via het intramembraanossificatieproces (IMO)7. Dit proces mist de angiogene stap, wat resulteert in onvoldoende in vivo vascularisatie van het transplantaat na implantatie 8,9,10, en daarom zijn benaderingen met een dergelijk proces mogelijk niet optimaal voor de behandeling van grote botdefecten 11.

Strategieën die worden toegepast om het endochondrale ossificatieproces (ECO) te recapituleren, een aangeboren mechanisme in skeletogenese tijdens de ontwikkeling, blijken aanzienlijke problemen te overwinnen die verband houden met traditionele IMO-gebaseerde benaderingen. In ECO geven chondrocyten in het kraakbeensjabloon vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) af, die vasculaire infiltratie en remodellering van het kraakbeensjabloon in bot bevordert12. De ECO-gemedieerde benadering van osteogenese via kraakbeenremodellering en angiogenese, die ook wordt geactiveerd tijdens fractuurherstel, maakt gebruik van kunstmatig gecreëerd kraakbeenweefsel afgeleid van MSC’s als primingmateriaal. Chondrocyten kunnen hypoxie bij botdefecten verdragen, angiogenese induceren en een vasculairvrij kraakbeentransplantaat omzetten in angiogeen weefsel. Talrijke studies hebben gemeld dat op MSC gebaseerde kraakbeentransplantaten in vivo bot genereren door een dergelijk ECO-programma te implementeren 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Een essentiële vereiste voor de klinische toepassing van deze ECO-gemedieerde benadering is hoe de gewenste hoeveelheid kraakbeentransplantaat in een klinische setting kan worden bereid. Het bereiden van klinisch kraakbeen van een grootte die past bij het werkelijke botdefect is niet praktisch. Daarom moet transplantaatkraakbeen integraal bot vormen wanneer meerdere fragmenten worden geïmplanteerd22. Hydrogels kunnen een aantrekkelijk hulpmiddel zijn voor het opschalen van weefselgemanipuleerde transplantaten voor endochondrale ossificatie. Veel natuurlijk afgeleide hydrogels ondersteunen de vorming van MSC-kraakbeen in vitro en ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Het optimale ondersteuningsmateriaal om aan de klinische toepassingsvereisten te voldoen, is echter onbepaald gebleven. Hyaluronzuur (HA) is een biologisch afbreekbaar en biocompatibel polysacharide dat aanwezig is in de extracellulaire matrix van kraakbeen33. HA interageert met MSC’s via oppervlaktereceptoren zoals CD44 om chondrogene differentiatie te ondersteunen 25,26,28,30,31,32,34. Bovendien bevorderen HA-steigers IMO-gemedieerde osteogene differentiatie van menselijke tandpulpstamcellen35, en scaffolds in combinatie met collageen bevorderen ECO-gemedieerde osteogenese36,37.

Hier presenteren we een methode voor het bereiden van HA-hydrogels met behulp van beenmerg-afgeleide volwassen menselijke MSC’s en hun gebruik voor hypertrofische chondrogenese in vitro en daaropvolgende endochondrale ossificatie in vivo38. We vergeleken de eigenschappen van HA met die van collageen, een materiaal dat veel wordt toegepast in botweefselengineering met MSC’s en een bruikbaar materiaal voor het opschalen van kunstmatige transplantaten voor endochondrale ossificatie17. In een immuungecompromitteerd muismodel werden HA- en collageenconstructen gezaaid met menselijke MSC’s geëvalueerd op in vivo ECO-potentieel door subcutane implantatie. De resultaten tonen aan dat HA-hydrogels uitstekend geschikt zijn als steiger voor MSC’s om kunstmatige kraakbeentransplantaten te maken die botvorming door middel van ECO mogelijk maken.

Het protocol is opgedeeld in twee stappen. Eerst worden constructen van menselijke MSC’s gezaaid op hyaluronzuurhydrogel bereid en gedifferentieerd tot hypertrofisch kraakbeen in vitro. Vervolgens worden de gedifferentieerde constructen subcutaan geïmplanteerd in een naaktmodel om endochondrale ossificatie in vivo te induceren (Figuur 1).

Protocol

Dit protocol maakt gebruik van mannelijke naaktmuizen van 4 weken oud. Huisvest vier muizen in een kooi onder een licht/donker-cyclus van 12 uur bij 22−24 °C en een relatieve luchtvochtigheid van 50%−70%. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Tokyo Medical and Dental University (goedkeurings-ID: A2019-204C, A2020-116A en A2021-121A). 1. Bereiding van buffers en reagent…

Representative Results

MSC-ingekapselde HA-hydrogels werden gekweekt in chondrogenisch medium aangevuld met TGFβ3, een inductor van chondrogenese41 (stap 4.1). We vergeleken de eigenschappen van HA met die van collageen, waarvan is aangetoond dat het effectief is bij het maken van op MSC gebaseerde kunstmatige kraakbeentransplantaten voor endochondrale ossificatie, zoals eerder beschreven38. Ongedifferentieerde MSC’s werden niet opgenomen als negatieve controles in deze studie omdat is aangetoon…

Discussion

Het gebruik van geschikte steigermaterialen die de overgang van hypertrofisch kraakbeen naar bot bevorderen, is een veelbelovende benadering om op MSC gebaseerde gemanipuleerde hypertrofische kraakbeentransplantaten op te schalen en botdefecten van klinisch significante grootte te behandelen. Hier laten we zien dat HA een uitstekend steigermateriaal is om de differentiatie van MSC-gebaseerd hypertrofisch kraakbeenweefsel in vitro te ondersteunen en om endochondrale botvorming in vivo te bevorderen <sup …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (subsidienrs. JP19K10259 en 22K10032 naar MAI).

Materials

0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
  4. Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
  5. Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  6. Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
  7. Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9 (2007).
  8. Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host’s vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
  9. Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues–the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
  10. Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
  11. Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
  12. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  13. Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
  14. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  15. Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
  16. Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
  17. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  18. Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
  19. van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
  20. Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
  21. Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
  22. Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
  23. Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
  24. Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
  25. Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
  26. Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
  27. Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
  28. Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
  29. Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
  30. Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
  31. Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton’s jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
  32. Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
  33. Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
  34. Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
  35. La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
  36. Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O’Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
  37. Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
  38. Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
  39. Zarembinski, T., Skardal, A. . Hydrogels – Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
  40. Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
  41. Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
  42. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  43. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  44. Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
  45. Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
  46. Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
  47. Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
  48. Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).

Tags

Mesenchymal Stem CellsBone FormationIn VivoEndochondral OssificationArtificial CartilageBone RegenerationAngiogenesisScaffoldCartilage DifferentiationCritical Size Bone DefectECO-mediated Approach
check_url/kr/65573?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image