Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.
Die konventionelle Knochenregenerationstherapie mit mesenchymalen Stammzellen (MSCs) ist bei Knochendefekten, die größer als die kritische Größe sind, schwierig anzuwenden, da sie keinen Mechanismus zur Induktion der Angiogenese hat. Die Implantation von künstlichem Knorpelgewebe, das aus MSCs hergestellt wird, induziert die Angiogenese und Knochenbildung in vivo durch endochondrale Ossifikation (ECO). Daher könnte dieser ECO-vermittelte Ansatz in Zukunft eine vielversprechende Knochenregenerationstherapie sein. Ein wichtiger Aspekt der klinischen Anwendung dieses ECO-vermittelten Ansatzes ist die Erstellung eines Protokolls zur Vorbereitung von genügend Knorpel für die Implantation zur Reparatur des Knochendefekts. Insbesondere ist es nicht praktikabel, eine einzelne Masse aus transplantiertem Knorpel in einer Größe zu entwerfen, die der Form des tatsächlichen Knochendefekts entspricht. Daher muss der zu transplantierende Knorpel die Eigenschaft haben, bei der Implantation mehrerer Stücke Knochen integral zu bilden. Hydrogele können ein attraktives Werkzeug für die Skalierung von Tissue-Engineering-Transplantaten für die endochondrale Ossifikation sein, um den klinischen Anforderungen gerecht zu werden. Obwohl viele natürlich gewonnene Hydrogele die MSC-Knorpelbildung in vitro und ECO in vivo unterstützen, muss das optimale Gerüstmaterial für die Anforderungen klinischer Anwendungen noch bestimmt werden. Hyaluronsäure (HA) ist ein entscheidender Bestandteil der extrazellulären Matrix des Knorpels und ist ein biologisch abbaubares und biokompatibles Polysaccharid. Hier zeigen wir, dass HA-Hydrogele hervorragende Eigenschaften haben, um die in vitro Differenzierung von MSC-basiertem Knorpelgewebe zu unterstützen und die endochondrale Knochenbildung in vivo zu fördern.
Autologer Knochen ist nach wie vor der Goldstandard für die Reparatur von Knochendefekten aufgrund von Traumata, angeborenen Defekten und chirurgischer Resektion. Die autogene Knochentransplantation hat jedoch erhebliche Einschränkungen, einschließlich Spenderschmerzen, Infektionsrisiko und begrenztes Knochenvolumen, das von den Patienten isoliert werden kann 1,2,3,4. Als Knochenersatz wurden zahlreiche Biomaterialien entwickelt, die natürliche oder synthetische Polymere mit mineralisierten Materialien wie Kalziumphosphat oder Hydroxylapatitkombinieren 5,6. Die Knochenbildung in diesen technischen Materialien wird in der Regel durch die Verwendung des mineralisierten Materials als Priming-Material erreicht, damit sich Stammzellen durch den Intramembran-Ossifikationsprozess (IMO) direkt in Osteoblasten differenzierenkönnen 7. Bei diesem Prozess fehlt der angiogene Schritt, was zu einer unzureichenden In-vivo-Vaskularisierung des Transplantats nach der Implantation führt 8,9,10, und daher sind Ansätze, die ein solches Verfahren verwenden, möglicherweise nicht optimal für die Behandlung großer Knochendefekte 11.
Es hat sich gezeigt, dass Strategien, die zur Rekapitulation des endochondralen Ossifikationsprozesses (ECO), einem angeborenen Mechanismus der Skelettgenese während der Entwicklung, angewendet werden, erhebliche Probleme überwinden, die mit traditionellen IMO-basierten Ansätzen verbunden sind. Bei ECO setzen Chondrozyten in der Knorpelschablone den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) frei, der die vaskuläre Infiltration und den Umbau der Knorpelschablone in Knochen fördert12. Der ECO-vermittelte Ansatz zur Osteogenese über Knorpelumbau und Angiogenese, der auch bei der Frakturreparatur aktiviert wird, verwendet künstlich erzeugtes Knorpelgewebe, das aus MSCs gewonnen wird, als Priming-Material. Chondrozyten können Hypoxie bei Knochendefekten tolerieren, Angiogenese induzieren und ein gefäßfreies Knorpeltransplantat in angiogenes Gewebe umwandeln. Zahlreiche Studien haben berichtet, dass MSC-basierte Knorpeltransplantate Knochen in vivo erzeugen, indem sie ein solches ECO-Programm implementieren 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Eine wesentliche Voraussetzung für die klinische Anwendung dieses ECO-vermittelten Ansatzes ist die Herstellung der gewünschten Menge an Knorpeltransplantaten in einem klinischen Umfeld. Die Herstellung von klinischem Knorpel in einer Größe, die zum tatsächlichen Knochendefekt passt, ist nicht praktikabel. Daher muss Transplantatknorpel Knochen integral bilden, wenn mehrere Fragmente implantiert werden22. Hydrogele können ein attraktives Werkzeug für die Skalierung von Tissue-Engineering-Transplantaten für die endochondrale Ossifikation sein. Viele natürlich gewonnene Hydrogele unterstützen die MSC-Knorpelbildung in vitro und ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Das optimale Trägermaterial, um die Anforderungen der klinischen Anwendung zu erfüllen, ist jedoch noch nicht festgelegt. Hyaluronsäure (HA) ist ein biologisch abbaubares und biokompatibles Polysaccharid, das in der extrazellulären Matrix des Knorpelsvorkommt 33. HA interagiert mit MSCs über Oberflächenrezeptoren wie CD44, um die chondrogene Differenzierung zu unterstützen 25,26,28,30,31,32,34. Darüber hinaus fördern HA-Scaffolds die IMO-vermittelte osteogene Differenzierung von Stammzellen der menschlichen Zahnpulpa35 und Scaffolds in Kombination mit Kollagen die ECO-vermittelte Osteogenese36,37.
In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Herstellung von HA-Hydrogelen unter Verwendung von aus dem Knochenmark gewonnenen adulten humanen MSCs vor und ihre Verwendung für die hypertrophe Chondrogenese in vitro und die anschließende endochondrale Ossifikation in vivo38. Wir verglichen die Eigenschaften von HA mit denen von Kollagen, einem Material, das im Bone Tissue Engineering mit MSCs weit verbreitet ist und ein nützliches Material für die Skalierung künstlicher Transplantate für die endochondrale Ossifikation ist17. In einem immungeschwächten Mausmodell wurden HA- und Kollagenkonstrukte, die mit humanen MSCs ausgesät waren, durch subkutane Implantation auf ihr in vivo ECO-Potenzial untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass HA-Hydrogele hervorragend als Gerüst für MSCs geeignet sind, um künstliche Knorpeltransplantate herzustellen, die die Knochenbildung durch ECO ermöglichen.
Das Protokoll gliedert sich in zwei Schritte. Zunächst werden Konstrukte von humanen MSCs, die auf Hyaluron-Hydrogel ausgesät sind, hergestellt und in vitro zu hypertrophem Knorpel differenziert. Als nächstes werden die differenzierten Konstrukte subkutan in ein Nacktmodell implantiert, um eine endochondrale Ossifikation in vivo zu induzieren (Abbildung 1).
Die Verwendung geeigneter Gerüstmaterialien, die den Übergang vom hypertrophen Knorpel zum Knochen fördern, ist ein vielversprechender Ansatz, um MSC-basierte hypertrophe Knorpeltransplantate zu skalieren und Knochendefekte klinisch signifikanter Größe zu behandeln. Hier zeigen wir, dass HA ein hervorragendes Gerüstmaterial ist, um die Differenzierung von MSC-basiertem hypertrophem Knorpelgewebe in vitro zu unterstützen und die endochondrale Knochenbildung in vivo zu fördern 38…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) unterstützt (Grant Nr. JP19K10259 und 22K10032 bis MAI).
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
dexamethasone | Merck | D8893 | |
Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
Dormicum | Astellas Pharma | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |