לטיפול בעצם באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית על ידי השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מתאי גזע מזנכימליים יש פוטנציאל לעקוף את החסרונות של טיפולים קונבנציונליים. הידרוג’ל חומצה היאלורונית יעיל בהגדלת שתלי סחוס ממוינים באופן אחיד, כמו גם ביצירת עצם משולבת עם כלי דם בין שתלים מאוחים in vivo.
טיפול קונבנציונלי בהתחדשות עצם באמצעות תאי גזע מזנכימליים (MSCs) קשה ליישום על פגמים בעצם גדולים מהגודל הקריטי מכיוון שאין לו מנגנון לגרימת אנגיוגנזה. השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מ-MSCs גורמת לאנגיוגנזה וליצירת עצם in vivo באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית (ECO). לכן, גישה זו בתיווך אקולוגי עשויה להיות טיפול מבטיח להתחדשות עצם בעתיד. היבט חשוב ביישום הקליני של גישה זו בתיווך אקולוגי הוא קביעת פרוטוקול להכנת מספיק סחוס להשתלה כדי לתקן את הפגם בעצם. במיוחד לא מעשי לתכנן מסה אחת של סחוס מושתל בגודל המתאים לצורת פגם העצם בפועל. לכן, הסחוס להשתלה חייב להיות בעל תכונה של יצירת עצם באופן אינטגרלי כאשר חלקים מרובים מושתלים. הידרוג’לים עשויים להיות כלי אטרקטיבי להרחבת שתלים מהונדסים רקמות עבור אוסיפיקציה אנדוכונדרלית כדי לעמוד בדרישות הקליניות. למרות שהידרוג’לים רבים ממקור טבעי תומכים בהיווצרות סחוס MSC in vitro ו- ECO in vivo, חומר הפיגום האופטימלי שיענה על הצרכים של יישומים קליניים טרם נקבע. חומצה היאלורונית (HA) היא מרכיב חיוני במטריצה החוץ תאית של הסחוס והיא פוליסכריד מתכלה ותואם ביולוגית. כאן, אנו מראים כי הידרוג’ל HA יש תכונות מצוינות לתמוך בהתמיינות חוץ גופית של רקמת סחוס מבוססת MSC ולקדם היווצרות עצם אנדוכונדרלית in vivo.
עצם אוטולוגית היא עדיין תקן הזהב לתיקון מומים בעצם עקב טראומה, מומים מולדים וכריתה כירורגית. עם זאת, להשתלת עצם אוטוגנית יש מגבלות משמעותיות, כולל כאב תורם, סיכון לזיהום ונפח עצם מוגבל שניתן לבודד מהחולים 1,2,3,4. ביו-חומרים רבים פותחו כתחליפי עצם, המשלבים פולימרים טבעיים או סינתטיים עם חומרים מינרליים כגון סידן פוספט או הידרוקסיאפטיט 5,6. היווצרות עצם בחומרים מהונדסים אלה מושגת בדרך כלל באמצעות החומר המינרלי כחומר ראשוני כדי לאפשר לתאי גזע להתמיין ישירות לאוסטאובלסטים באמצעות תהליך האוסיפיקציה התוך-ממברנית (IMO)7. תהליך זה חסר את השלב האנגיוגני, וכתוצאה מכך אין מספיק וסקולריזציה in vivo של השתל לאחר ההשתלה 8,9,10, ולכן גישות המשתמשות בתהליך כזה עשויות שלא להיות אופטימליות לטיפול במומים גדולים בעצמות 11.
אסטרטגיות המיושמות כדי לשחזר את תהליך האוסיפיקציה האנדוכונדרלית (ECO), מנגנון מולד בשלד במהלך הפיתוח, הוכחו כמתגברות על בעיות משמעותיות הקשורות לגישות מסורתיות מבוססות IMO. ב- ECO, כונדרוציטים בתבנית הסחוס משחררים גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF), אשר מקדם הסננה וסקולרית ועיצוב מחדש של תבנית הסחוס לעצם12. הגישה בתיווך אקולוגי לאוסטאוגנזה באמצעות עיצוב מחדש של סחוס ואנגיוגנזה, המופעלת גם במהלך תיקון שבר, משתמשת ברקמת סחוס שנוצרה באופן מלאכותי שמקורה ב- MSCs כחומר ראשוני. כונדרוציטים יכולים לסבול היפוקסיה במומים בעצמות, לגרום לאנגיוגנזה ולהמיר שתל סחוס ללא כלי דם לרקמה אנגיוגנית. מחקרים רבים דיווחו כי שתלי סחוס מבוססי MSC מייצרים עצם in vivo על ידי יישום תוכנית ECO כזו 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
דרישה חיונית ליישום קליני של גישה זו בתיווך אקולוגי היא כיצד להכין את הכמות הרצויה של שתל סחוס בסביבה קלינית. הכנת סחוס קליני בגודל המתאים לפגם העצם בפועל אינה מעשית. לכן, סחוס השתל חייב ליצור עצם באופן אינטגרלי כאשר מושתלים שברים מרובים22. הידרוג’לים עשויים להיות כלי אטרקטיבי להרחבת שתלים מהונדסים רקמות לאוסיפיקציה אנדוכונדרלית. הידרוג’לים רבים ממקור טבעי תומכים בהיווצרות סחוס MSC במבחנה ו- ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; עם זאת, חומר התמיכה האופטימלי שיעמוד בדרישות היישום הקליני טרם נקבע. חומצה היאלורונית (HA) היא פוליסכריד מתכלה ותואם ביולוגית הנמצא במטריצה החוץ תאית של סחוס33. חומצה היאלורונית מקיימת אינטראקציה עם MSCs באמצעות קולטני שטח כגון CD44 לתמיכה בהתמיינות כונדרוגנית 25,26,28,30,31,32,34. בנוסף, פיגומים HA מקדמים התמיינות אוסטאוגנית בתיווך IMO של תאי גזע אנושיים ממוך השן35, ופיגומים בשילוב עם קולגן מקדמים אוסטאוגנזה36,37 בתיווך אקולוגי.
כאן, אנו מציגים שיטה להכנת הידרוג’לים HA באמצעות MSCs אנושיים בוגרים שמקורם במח עצם והשימוש בהם עבור chondrogenesis in vitro hypertrophic ולאחר מכן ossification endochondral in vivo38. השווינו את המאפיינים של חומצה היאלורונית לאלה של קולגן, חומר הנמצא בשימוש נרחב בהנדסת רקמת עצם עם MSCs וחומר שימושי להרחבת שתלים מלאכותיים עבור אוסיפיקציה אנדוכונדרלית17. במודל עכבר מדוכא חיסון, מבני HA וקולגן שנזרעו עם MSCs אנושיים הוערכו עבור פוטנציאל ECO in vivo על ידי השתלה תת עורית. התוצאות מראות כי הידרוג’ל HA מצוין כפיגום עבור MSCs ליצירת שתלי סחוס מלאכותיים המאפשרים היווצרות עצם באמצעות ECO.
הפרוטוקול מחולק לשני שלבים. ראשית, מבנים של MSCs אנושיים שנזרעו על הידרוג’ל היאלורונן מוכנים ומובחנים לסחוס היפרטרופי במבחנה. לאחר מכן, המבנים המובחנים מושתלים באופן תת-עורי במודל עירום כדי לגרום לאוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo (איור 1).
שימוש בחומרי פיגומים מתאימים המקדמים את המעבר מסחוס היפרטרופי לעצם הוא גישה מבטיחה להרחבת שתלי סחוס היפרטרופיים מהונדסים מבוססי MSC ולטיפול במומי עצם בגודל משמעותי מבחינה קלינית. כאן, אנו מראים כי HA הוא חומר פיגום מצוין לתמיכה בהתמיינות של רקמת סחוס היפרטרופית מבוססת MSC במבחנה ולקידו…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק סיוע למחקר מדעי (KAKENHI) מהאגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) (מענק מס. JP19K10259 ו- 22K10032 ל- MAI).
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
dexamethasone | Merck | D8893 | |
Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
Dormicum | Astellas Pharma | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |