Benterapi via endokondral ossifikasjon ved implantering av kunstig bruskvev produsert fra mesenkymale stamceller har potensial til å omgå ulempene ved konvensjonelle terapier. Hyaluronsyrehydrogeler er effektive for å skalere opp jevnt differensierte brusktransplantater, samt skape integrert bein med vaskularisering mellom smeltede transplantater in vivo.
Konvensjonell benregenereringsterapi ved bruk av mesenkymale stamceller (MSC) er vanskelig å anvende på beindefekter større enn den kritiske størrelsen fordi den ikke har en mekanisme for å indusere angiogenese. Implantering av kunstig bruskvev fremstilt fra MSC induserer angiogenese og beindannelse in vivo via endokondral ossifikasjon (ECO). Derfor kan denne økomedierte tilnærmingen være en lovende benregenereringsterapi i fremtiden. Et viktig aspekt ved den kliniske anvendelsen av denne økomedierte tilnærmingen er å etablere en protokoll for å forberede nok brusk til å bli implantert for å reparere beindefekten. Det er spesielt ikke praktisk å designe en enkelt masse podet brusk av en størrelse som samsvarer med formen på den faktiske beindefekten. Derfor må brusken som skal transplanteres ha egenskapen til å danne bein integrert når flere stykker er implantert. Hydrogeler kan være et attraktivt verktøy for å skalere opp vevskonstruerte transplantater for endokondral ossifikasjon for å møte kliniske krav. Selv om mange naturlig avledede hydrogeler støtter MSC-bruskdannelse in vitro og ECO in vivo, er det optimale stillasmaterialet for å møte behovene til kliniske applikasjoner ennå ikke bestemt. Hyaluronsyre (HA) er en avgjørende komponent i den ekstracellulære bruskmatriksen og er et biologisk nedbrytbart og biokompatibelt polysakkarid. Her viser vi at HA-hydrogeler har utmerkede egenskaper for å støtte in vitro differensiering av MSC-basert bruskvev og fremme endokondral beindannelse in vivo.
Autolog bein er fortsatt gullstandarden for å reparere beindefekter på grunn av traumer, medfødte defekter og kirurgisk reseksjon. Imidlertid har autogen bentransplantasjon betydelige begrensninger, inkludert donorsmerter, risiko for infeksjon og begrenset benvolum som kan isoleres fra pasientene 1,2,3,4. Tallrike biomaterialer har blitt utviklet som bensubstitutter, som kombinerer naturlige eller syntetiske polymerer med mineraliserte materialer som kalsiumfosfat eller hydroksyapatitt 5,6. Bendannelse i disse konstruerte materialene oppnås vanligvis ved å bruke det mineraliserte materialet som et primingmateriale for å tillate stamceller å differensiere direkte til osteoblaster gjennom intramembran ossification (IMO) prosess7. Denne prosessen mangler det angiogene trinnet, noe som resulterer i utilstrekkelig in vivo vaskularisering av transplantatet etter implantasjon 8,9,10, og derfor kan tilnærminger som bruker en slik prosess ikke være optimale for behandling av store beindefekter 11.
Strategier anvendt for å rekapitulere endokondral ossifikasjon (ECO) prosess, en medfødt mekanisme i skjelettogenese under utvikling, har vist seg å overvinne betydelige problemer forbundet med tradisjonelle IMO-baserte tilnærminger. I ECO frigjør kondrocytter i bruskmalen vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), som fremmer vaskulær infiltrasjon og remodellering av bruskmalen til bein12. Den ECO-medierte tilnærmingen til osteogenese via bruskremodellering og angiogenese, som også aktiveres under bruddreparasjon, bruker kunstig opprettet bruskvev avledet fra MSC som et primingmateriale. Kondrocytter kan tolerere hypoksi i beindefekter, indusere angiogenese og konvertere et vaskulært brusktransplantat til angiogent vev. Tallrike studier har rapportert at MSC-baserte brusktransplantater genererer bein in vivo ved å implementere et slikt ECO-program 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Et viktig krav for den kliniske anvendelsen av denne øko-medierte tilnærmingen er hvordan man forbereder ønsket mengde brusktransplantat i en klinisk setting. Fremstilling av klinisk brusk av en størrelse som passer til selve beindefekten er ikke praktisk. Derfor må graftbrusk danne bein integrert når flere fragmenter implanteres22. Hydrogeler kan være et attraktivt verktøy for å skalere opp vevskonstruerte transplantater for endokondral ossifisering. Mange naturlig utvunnede hydrogeler støtter MSC-bruskdannelse in vitro og ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Det optimale støttematerialet for å oppfylle kravene til klinisk anvendelse er imidlertid ikke bestemt. Hyaluronsyre (HA) er et biologisk nedbrytbart og biokompatibelt polysakkarid tilstede i den ekstracellulære matrisen av brusk33. HA interagerer med MSC via overflatereseptorer som CD44 for å støtte kondrogen differensiering 25,26,28,30,31,32,34. I tillegg fremmer HA-stillas IMO-mediert osteogen differensiering av humane pulpstamceller35, og stillas kombinert med kollagen fremmer ECO-mediert osteogenese36,37.
Her presenterer vi en metode for fremstilling av HA-hydrogeler ved bruk av benmargsderiverte voksne humane MSC og deres bruk for hypertrofisk kondrogenese in vitro og påfølgende endokondral ossifikasjon in vivo38. Vi sammenlignet egenskapene til HA med kollagen, et materiale som er mye brukt i beinvevsteknikk med MSC og et nyttig materiale for å skalere opp kunstige transplantater for endokondral ossifikasjon17. I en immunkompromittert musemodell ble HA- og kollagenkonstruksjoner sådd med humane MSC evaluert for in vivo ECO-potensiale ved subkutan implantasjon. Resultatene viser at HA-hydrogeler er utmerket som stillas for MSC for å lage kunstige brusktransplantater som tillater beindannelse gjennom ECO.
Protokollen er delt inn i to trinn. Først fremstilles konstruksjoner av humane MSC-er sådd på hyaluronhydrogel og differensieres til hypertrofisk brusk in vitro. Deretter implanteres de differensierte konstruksjonene subkutant i en nakenmodell for å indusere endokondral ossifikasjon in vivo (figur 1).
Bruk av passende stillasmaterialer som fremmer overgangen fra hypertrofisk brusk til bein, er en lovende tilnærming til å skalere opp MSC-baserte konstruerte hypertrofiske brusktransplantater og behandle beindefekter av klinisk signifikant størrelse. Her viser vi at HA er et utmerket stillasmateriale for å støtte differensiering av MSC-basert hypertrofisk bruskvev in vitro og for å fremme endokondral beindannelse in vivo38. Videre ble in vivo HA-konstruksjoner vist…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (grant nos. JP19K10259 og 22K10032 til MAI).
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
dexamethasone | Merck | D8893 | |
Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
Dormicum | Astellas Pharma | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |