Костная терапия с помощью эндохондральной оссификации путем имплантации искусственной хрящевой ткани, полученной из мезенхимальных стволовых клеток, может обойти недостатки традиционных методов лечения. Гидрогели гиалуроновой кислоты эффективны для масштабирования равномерно дифференцированных хрящевых трансплантатов, а также для создания интегрированной кости с васкуляризацией между сросшимися трансплантатами in vivo.
Традиционная терапия костной регенерации с использованием мезенхимальных стволовых клеток (МСК) трудно применима к костным дефектам, превышающим критический размер, поскольку она не имеет механизма индуцирования ангиогенеза. Имплантация искусственной хрящевой ткани, изготовленной из МСК, индуцирует ангиогенез и формирование костной ткани in vivo посредством эндохондральной оссификации (ЭКО). Таким образом, этот ЭКО-опосредованный подход может стать многообещающей терапией регенерации костной ткани в будущем. Важным аспектом клинического применения этого ЭКО-опосредованного подхода является создание протокола подготовки достаточного количества хряща для имплантации для восстановления костного дефекта. Особенно непрактично создавать единичную массу трансплантированного хряща такого размера, который соответствует форме фактического костного дефекта. Таким образом, хрящ, подлежащий пересадке, должен обладать свойством формировать кость интегрально при имплантации нескольких частей. Гидрогели могут быть привлекательным инструментом для масштабирования тканеинженерных трансплантатов для эндохондральной оссификации в соответствии с клиническими требованиями. Несмотря на то, что многие гидрогели природного происхождения поддерживают образование хряща МСК in vitro и ECO in vivo, оптимальный материал каркаса для удовлетворения потребностей клинического применения еще предстоит определить. Гиалуроновая кислота (ГК) является важнейшим компонентом хрящевого внеклеточного матрикса и представляет собой биоразлагаемый и биосовместимый полисахарид. Здесь мы показываем, что гидрогели ГК обладают превосходными свойствами поддерживать дифференцировку хрящевой ткани на основе МСК in vitro и способствовать образованию эндохондральной кости in vivo.
Аутологичная кость по-прежнему является золотым стандартом для восстановления костных дефектов, вызванных травмами, врожденными дефектами и хирургической резекцией. Однако аутогенная костная пластика имеет существенные ограничения, включая боль донора, риск инфекции и ограниченный объем костной ткани, который может быть выделен у пациентов 1,2,3,4. В качестве заменителей костной ткани были разработаны многочисленные биоматериалы, сочетающие природные или синтетические полимеры с минерализованными материалами, такими как фосфат кальция или гидроксиапатит 5,6. Формирование костной ткани в этих конструкционных материалах обычно достигается с использованием минерализованного материала в качестве грунтовочного материала, позволяющего стволовым клеткам дифференцироваться непосредственно в остеобласты посредством процесса внутримембранного окостенения (ИМО)7. В этом процессе отсутствует ангиогенная стадия, что приводит к недостаточной васкуляризации трансплантата in vivo после имплантации 8,9,10, в связи с чем подходы, использующие такой процесс, могут быть не оптимальными для лечения крупных костных дефектов 11.
Было показано, что стратегии, применяемые для повторения процесса эндохондральной оссификации (ЭКО), врожденного механизма скелетогенеза в процессе развития, позволяют преодолеть значительные проблемы, связанные с традиционными подходами, основанными на ИМО. При ЭКО хондроциты в хрящевой матрице высвобождают сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который способствует сосудистой инфильтрации и ремоделированию хрящевой матрицы в кость12. ECO-опосредованный подход к остеогенезу через ремоделирование хряща и ангиогенез, который также активируется во время восстановления перелома, использует искусственно созданную хрящевую ткань, полученную из МСК, в качестве грунтовочного материала. Хондроциты могут переносить гипоксию при костных дефектах, индуцировать ангиогенез и превращать бессосудистый хрящевой трансплантат в ангиогенную ткань. Многочисленные исследования показали, что хрящевые трансплантаты на основе МСК генерируют костную ткань in vivo путем реализации такой программы ECO 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Существенным требованием для клинического применения этого ЭКО-опосредованного подхода является подготовка желаемого количества хрящевого трансплантата в клинических условиях. Препарирование клинического хряща такого размера, который соответствует фактическому дефекту кости, нецелесообразно. Таким образом, хрящ трансплантата должен образовывать костную ткань интегрально при имплантации нескольких фрагментов22. Гидрогели могут быть привлекательным инструментом для масштабирования тканеинженерных трансплантатов для эндохондральной оссификации. Многие гидрогели природного происхождения поддерживают образование хряща МСК in vitro и ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Тем не менее, оптимальный вспомогательный материал, отвечающий требованиям клинического применения, остается неопределенным. Гиалуроновая кислота (ГК) представляет собой биоразлагаемый и биосовместимый полисахарид, присутствующий во внеклеточном матриксе хряща33. Гиалуроновая кислота взаимодействует с МСК через поверхностные рецепторы, такие как CD44, поддерживая хондрогенную дифференцировку 25,26,28,30,31,32,34. Кроме того, скаффолды с гиалуроновой кислотой способствуют ИМО-опосредованной остеогенной дифференцировке стволовых клеток пульпы зуба человека35, а скаффолды в сочетании с коллагеном способствуют ЭКО-опосредованному остеогенезу36,37.
В данной работе мы представляем способ получения гидрогелей ГК с использованием МСК взрослого человека, полученных из костного мозга, и их использование для гипертрофического хондрогенеза in vitro и последующей эндохондральной оссификации in vivo38. Мы сравнили характеристики гиалуроновой кислоты с характеристиками коллагена, материала, широко применяемого в инженерии костной ткани с МСК и полезного материала для масштабирования искусственных трансплантатов для эндохондральной оссификации17. В мышиной модели с ослабленным иммунитетом гиалуроновая кислота и коллагеновые конструкции, засеянные человеческими МСК, оценивали потенциал ЭКО in vivo путем подкожной имплантации. Результаты показывают, что гидрогели ГК отлично подходят в качестве каркаса для МСК для создания искусственных хрящевых трансплантатов, которые позволяют формировать костную ткань с помощью ЭКО.
Протокол разделен на два этапа. Сначала готовят конструкции человеческих МСК, засеянных на гиалуроновый гидрогель, и дифференцируют их в гипертрофированный хрящ in vitro. Затем дифференцированные конструкции имплантируются подкожно в обнаженную модель, чтобы индуцировать эндохондральное окостенение in vivo (рис. 1).
Использование соответствующих материалов каркаса, способствующих переходу от гипертрофированного хряща к кости, является перспективным подходом к масштабированию инженерных гипертрофических хрящевых трансплантатов на основе МСК и лечению костных дефектов клинически значимого ра?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом на научные исследования (KAKENHI) Японского общества содействия науке (JSPS) (грант No 1). JP19K10259 и 22К10032 в МАИ).
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
dexamethasone | Merck | D8893 | |
Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
Dormicum | Astellas Pharma | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |