Integrerad benbildning genom endokondral benbildning in vivo med hjälp av mesenkymala stamceller

Summary

Benterapi via endokondral benbildning genom implantation av konstgjord broskvävnad framställd av mesenkymala stamceller har potential att kringgå nackdelarna med konventionella terapier. Hyaluronsyrahydrogeler är effektiva för att skala upp likformigt differentierade brosktransplantat samt skapa integrerat ben med vaskularisering mellan sammansmälta transplantat in vivo.

Abstract

Konventionell benregenereringsterapi med mesenkymala stamceller (MSC) är svår att tillämpa på bendefekter som är större än den kritiska storleken eftersom den inte har någon mekanism för att inducera angiogenes. Implantation av konstgjord broskvävnad tillverkad från MSC inducerar angiogenes och benbildning in vivo via endokondral ossifiering (ECO). Därför kan detta ECO-medierade tillvägagångssätt vara en lovande benregenereringsterapi i framtiden. En viktig aspekt av den kliniska tillämpningen av detta ECO-medierade tillvägagångssätt är att upprätta ett protokoll för att förbereda tillräckligt med brosk som ska implanteras för att reparera bendefekten. Det är särskilt inte praktiskt att konstruera en enda massa ympat brosk av en storlek som överensstämmer med formen på den faktiska bendefekten. Därför måste brosket som ska transplanteras ha egenskapen att bilda ben integrerat när flera bitar implanteras. Hydrogeler kan vara ett attraktivt verktyg för att skala upp vävnadskonstruerade transplantat för endokondral benbildning för att möta kliniska krav. Även om många naturligt framställda hydrogeler stöder MSC-broskbildning in vitro och ECO in vivo, har det optimala ställningsmaterialet för att möta behoven i kliniska tillämpningar ännu inte fastställts. Hyaluronsyra (HA) är en avgörande komponent i broskets extracellulära matris och är en biologiskt nedbrytbar och biokompatibel polysackarid. Här visar vi att HA-hydrogeler har utmärkta egenskaper för att stödja in vitro-differentiering av MSC-baserad broskvävnad och främja endokondral benbildning in vivo.

Introduction

Autologt ben är fortfarande guldstandarden för att reparera bendefekter på grund av trauma, medfödda defekter och kirurgisk resektion. Autogen bentransplantation har dock betydande begränsningar, inklusive donatorsmärta, infektionsrisk och begränsad benvolym som kan isoleras från patienterna 1,2,3,4. Många biomaterial har utvecklats som bensubstitut och kombinerar naturliga eller syntetiska polymerer med mineraliserade material som kalciumfosfat eller hydroxiapatit ^5,6. Benbildning i dessa konstruerade material uppnås vanligtvis med hjälp av det mineraliserade materialet som ett primingmaterial för att tillåta stamceller att differentiera direkt till osteoblaster genom intramembranbenbildningsprocessen⁽IMO) 7. Denna process saknar det angiogena steget, vilket resulterar i otillräcklig in vivo vaskularisering av transplantatet efter implantation 8,9,10^, och därför kan metoder som använder en sådan process inte vara optimala för behandling av stora bendefekter ¹¹.

Strategier som används för att rekapitulera den endokondrala benbildningsprocessen (ECO), en medfödd mekanism i skelettbildningen under utvecklingen, har visat sig övervinna betydande problem i samband med traditionella IMO-baserade metoder. I ECO frigör kondrocyter i broskmallen vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), vilket främjar vaskulär infiltration och ombyggnad av broskmallen till ben¹². Det ECO-medierade tillvägagångssättet för osteogenes via broskremodellering och angiogenes, som också aktiveras under frakturreparation, använder artificiellt skapad broskvävnad härledd från MSC som primingmaterial. Kondrocyter kan tolerera hypoxi vid bendefekter, inducera angiogenes och omvandla ett kärlfritt brosktransplantat till angiogen vävnad. Många studier har rapporterat att MSC-baserade brosktransplantat genererar ben in vivo genom att implementera ett sådant ECO-program 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Ett viktigt krav för den kliniska tillämpningen av detta ECO-medierade tillvägagångssätt är hur man förbereder den önskade mängden brosktransplantat i en klinisk miljö. Att förbereda kliniskt brosk av en storlek som passar den faktiska bendefekten är inte praktiskt. Därför måste transplantatbrosk bilda ben integrerat när flera fragment implanteras²². Hydrogeler kan vara ett attraktivt verktyg för att skala upp vävnadskonstruerade transplantat för endokondral benbildning. Många naturligt framställda hydrogeler stöder MSC-broskbildning in vitro och ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Det optimala stödmaterialet för att uppfylla de kliniska tillämpningskraven har dock inte fastställts. Hyaluronsyra (HA) är en biologiskt nedbrytbar och biokompatibel polysackarid som finns i den extracellulära matrisen av brosk³³. HA interagerar med MSC via ytreceptorer såsom CD44 för att stödja kondrogen differentiering 25,26,28,30,31,32,34. Dessutom främjar HA-stödstrukturer IMO-medierad osteogen differentiering av mänskliga tandpulpastamceller³⁵, och stödstrukturer i kombination med kollagen främjar ECO-medierad osteogenes^36,37.

Här presenterar vi en metod för att framställa HA-hydrogeler med hjälp av benmärgshärledda vuxna humana MSC och deras användning för hypertrofisk kondrogenes in vitro och efterföljande endokondral benbildning in vivo³⁸. Vi jämförde egenskaperna hos HA med kollagen, ett material som används i stor utsträckning inom benvävnadsteknik med MSC och ett användbart material för att skala upp artificiella transplantat för endokondral ossifikation¹⁷. I en immunsupprimerad musmodell utvärderades HA- och kollagenkonstruktioner sådda med humana MSC för in vivo ECO-potential genom subkutan implantation. Resultaten visar att HA-hydrogeler är utmärkta som en byggnadsställning för MSC för att skapa konstgjorda brosktransplantat som tillåter benbildning genom ECO.

Protokollet är uppdelat i två steg. Först prepareras konstruktioner av humana MSC sådda på hyaluronanhydrogel och differentieras till hypertrofiskt brosk in vitro. Därefter implanteras de differentierade konstruktionerna subkutant i en nakenmodell för att inducera endokondral benbildning in vivo (Figur 1).

Protocol

Detta protokoll använder 4 veckor gamla nakna hanmöss. Inhys fyra möss i en bur under en 12 timmars ljus/mörker-cykel vid 22−24 °C och 50%−70% relativ luftfuktighet. Alla djurförsök utfördes i enlighet med de riktlinjer som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of Tokyo Medical and Dental University (godkännande-ID: A2019-204C, A2020-116A och A2021-121A). 1. Beredning av buffertar och reagenser Bered mesenkymala stamcellsodlingsmedium …

Representative Results

MSC-inkapslade HA-hydrogeler odlades i kondrogent medium kompletterat med TGFβ3, en inducerare av kondrogenes41 (steg 4.1). Vi jämförde egenskaperna hos HA med egenskaperna hos kollagen, som har visat sig vara effektiva för att skapa MSC-baserade konstgjorda brosktransplantat för endokondral benbildning, som beskrivits tidigare38. Odifferentierade MSC inkluderades inte som negativa kontroller i denna studie eftersom det har visats att odifferentierade MSC kräver miner…

Discussion

Att använda lämpliga byggnadsmaterial som främjar övergången från hypertrofiskt brosk till ben är ett lovande tillvägagångssätt för att skala upp MSC-baserade konstruerade hypertrofiska brosktransplantat och behandla bendefekter av kliniskt signifikant storlek. Här visar vi att HA är ett utmärkt byggnadsmaterial för att stödja differentieringen av MSC-baserad hypertrofisk broskvävnad in vitro och för att främja endokondral benbildning in vivo³⁸. Dessutom, i…

Materials

0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
basic fibroblastic growth factor	Reprocell	RCHEOT002
bovine serum albumin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	C10283
dexamethasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
Gentamicin sulfate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Haccpper Generator	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G supplement	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	×100
L-Alanyl-L-Glutamine	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (×100)
L-proline	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxine	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332