JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Mezenkimal Kök Hücreler Kullanılarak İn Vivo Endokondral Ossifikasyon Yoluyla Entegre Kemik Oluşumu

Published: July 14, 2023
doi:
10.3791/65573
, , ,
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University

Summary

Mezenkimal kök hücrelerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesiyle endokondral kemikleşme yoluyla kemik tedavisi, geleneksel tedavilerin dezavantajlarını aşma potansiyeline sahiptir. Hyaluronik asit hidrojelleri, in vivo kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ile entegre kemik oluşturmanın yanı sıra homojen olarak farklılaşmış kıkırdak greftlerinin ölçeklendirilmesinde etkilidir.

Abstract

Mezenkimal kök hücreler (MSC’ler) kullanılarak yapılan konvansiyonel kemik rejenerasyon tedavisinin, anjiyogenezi indükleyecek bir mekanizmaya sahip olmadığı için kritik boyuttan daha büyük kemik defektlerine uygulanması zordur. MSC’lerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesi, endokondral ossifikasyon (ECO) yoluyla in vivo anjiyogenez ve kemik oluşumunu indükler. Bu nedenle, bu EKO aracılı yaklaşım gelecekte umut verici bir kemik rejenerasyon tedavisi olabilir. Bu EKO aracılı yaklaşımın klinik uygulamasının önemli bir yönü, kemik defektini onarmak için implante edilecek yeterli kıkırdağın hazırlanması için bir protokol oluşturmaktır. Gerçek kemik defektinin şekline uyan boyutta tek bir greftli kıkırdak kütlesi tasarlamak özellikle pratik değildir. Bu nedenle, nakledilecek kıkırdak, birden fazla parça implante edildiğinde bütünleşik olarak kemik oluşturma özelliğine sahip olmalıdır. Hidrojeller, klinik gereksinimleri karşılamak için endokondral kemikleşme için doku mühendisliği greftlerini büyütmek için çekici bir araç olabilir. Doğal olarak türetilen birçok hidrojel, in vitro olarak MSC kıkırdak oluşumunu ve in vivo olarak ECO’yu desteklese de, klinik uygulamaların ihtiyaçlarını karşılamak için en uygun iskele malzemesi henüz belirlenmemiştir. Hyaluronik asit (HA), kıkırdak hücre dışı matrisinin çok önemli bir bileşenidir ve biyolojik olarak parçalanabilen ve biyouyumlu bir polisakkarittir. Burada, HA hidrojellerinin, MSC bazlı kıkırdak dokusunun in vitro farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel özelliklere sahip olduğunu gösteriyoruz.

Introduction

Otolog kemik, travma, konjenital defektler ve cerrahi rezeksiyona bağlı kemik defektlerinin onarımında hala altın standarttır. Bununla birlikte, otojen kemik greftinin donör ağrısı, enfeksiyon riski ve hastalardan izole edilebilecek sınırlı kemik hacmi gibi önemli sınırlamaları vardır 1,2,3,4. Doğal veya sentetik polimerleri kalsiyum fosfat veya hidroksiapatit 5,6 gibi mineralize malzemelerle birleştiren kemik ikameleri olarak çok sayıda biyomalzeme geliştirilmiştir. Bu mühendislik malzemelerinde kemik oluşumu, kök hücrelerin zar içi kemikleşme (IMO) işlemi yoluyla doğrudan osteoblastlara farklılaşmasına izin vermek için genellikle mineralize malzeme bir astar malzemesi olarak kullanılarak elde edilir7. Bu işlem anjiyojenik adımdan yoksundur, bu da implantasyondan sonra greftin yetersiz in vivo vaskülarizasyonuna neden olur 8,9,10 ve bu nedenle, böyle bir işlemi kullanan yaklaşımlar büyük kemik kusurlarını tedavi etmek için optimal olmayabilir 11.

Gelişim sırasında iskeletogenezde doğuştan gelen bir mekanizma olan endokondral ossifikasyon (ECO) sürecini özetlemek için uygulanan stratejilerin, geleneksel IMO tabanlı yaklaşımlarla ilişkili önemli sorunların üstesinden geldiği gösterilmiştir. EKO’da, kıkırdak şablonundaki kondrositler, vasküler infiltrasyonu ve kıkırdak şablonunun kemiğe yeniden şekillenmesini destekleyen vasküler endotelyal büyüme faktörünü (VEGF) serbest bırakır12. Kırık onarımı sırasında da aktive olan kıkırdak yeniden şekillenmesi ve anjiyogenez yoluyla osteogeneze ECO aracılı yaklaşım, MSC’lerden türetilen yapay olarak oluşturulmuş kıkırdak dokusunu bir astar materyali olarak kullanır. Kondrositler kemik defektlerinde hipoksiyi tolere edebilir, anjiyogenezi indükleyebilir ve vasküler serbest kıkırdak greftini anjiyojenik dokuya dönüştürebilir. Çok sayıda çalışma, MSC bazlı kıkırdak greftlerinin böyle bir ECO programı uygulayarak in vivo kemik ürettiğini bildirmiştir 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Bu EKO aracılı yaklaşımın klinik uygulaması için temel bir gereklilik, klinik ortamda istenen miktarda kıkırdak greftinin nasıl hazırlanacağıdır. Gerçek kemik defektine uyan boyutta klinik kıkırdak hazırlamak pratik değildir. Bu nedenle, greft kıkırdağı, birden fazla parça implante edildiğinde bütünleşik olarak kemik oluşturmalıdır22. Hidrojeller, endokondral kemikleşme için doku mühendisliği yapılmış greftlerin ölçeklendirilmesi için çekici bir araç olabilir. Doğal olarak türetilen birçok hidrojel, in vitro MSC kıkırdak oluşumunu ve in vivo ECO 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Bununla birlikte, klinik uygulama gereksinimlerini karşılamak için en uygun destek materyali belirlenememiştir. Hyaluronik asit (HA), kıkırdak33’ün hücre dışı matrisinde bulunan biyolojik olarak parçalanabilen ve biyouyumlu bir polisakkarittir. HA, kondrojenik farklılaşmayı desteklemek için CD44 gibi yüzey reseptörleri aracılığıyla MSC’lerle etkileşime girer 25,26,28,30,31,32,34. Ek olarak, HA iskeleleri, insan diş pulpası kök hücrelerinin35 IMO aracılı osteojenik farklılaşmasını teşvik eder ve kollajen ile birleştirilen iskeleler, ECO aracılı osteogenezi36,37 destekler.

Burada, kemik iliğinden türetilmiş yetişkin insan MSC’leri kullanılarak HA hidrojellerinin hazırlanması ve bunların in vitro hipertrofik kondrogenez ve ardından endokondral ossifikasyon için kullanımı için bir yöntem sunuyoruz in vivo38. HA’nın özelliklerini, kemik dokusu mühendisliğinde MSC’lerle yaygın olarak uygulanan bir malzeme olan ve endokondral ossifikasyon için yapay greftlerin ölçeklendirilmesi için yararlı bir malzeme olan kollajen ile karşılaştırdık17. İmmün sistemi baskılanmış bir fare modelinde, insan MSC’leri ile tohumlanan HA ve kollajen yapıları, deri altı implantasyon ile in vivo ECO potansiyeli açısından değerlendirildi. Sonuçlar, HA hidrojellerinin, MSC’lerin ECO yoluyla kemik oluşumuna izin veren yapay kıkırdak greftleri oluşturması için bir iskele olarak mükemmel olduğunu göstermektedir.

Protokol iki adıma ayrılmıştır. İlk olarak, hyaluronan hidrojel üzerine tohumlanan insan MSC’lerinin yapıları hazırlanır ve in vitro olarak hipertrofik kıkırdağa farklılaştırılır. Daha sonra, farklılaşmış yapılar, in vivo endokondral ossifikasyonu indüklemek için çıplak bir modelde deri altına implante edilir (Şekil 1).

Protocol

Bu protokolde 4 haftalık çıplak erkek fareler kullanılır. Dört fareyi 22−24 °C ve − bağıl nemde 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü altında bir kafeste barındırın. Tüm hayvan deneyleri, Tokyo Tıp ve Diş Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir (onay kimliği: A2019-204C, A2020-116A ve A2021-121A). 1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması <l…

Representative Results

MSC kapsüllü HA hidrojeller, kondrogenez41’in bir indükleyicisi olan TGFβ3 ile takviye edilmiş kondrojenik ortamda kültürlendi (adım 4.1). HA’nın özelliklerini, daha önce tarif edildiği gibi, endokondral kemikleşme için MSC bazlı yapay kıkırdak greftleri oluşturmada etkili olduğu gösterilen kollajen özellikleriyle karşılaştırdık38. Farklılaşmamış MSC’ler bu çalışmaya negatif kontroller olarak dahil edilmemiştir, çünkü farklılaşmamış …

Discussion

Hipertrofik kıkırdaktan kemiğe geçişi destekleyen uygun iskele materyallerinin kullanılması, MSC bazlı tasarlanmış hipertrofik kıkırdak greftlerini büyütmek ve klinik olarak anlamlı boyuttaki kemik kusurlarını tedavi etmek için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, HA’nın in vitro olarak MSC bazlı hipertrofik kıkırdak dokusunun farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel bir iskele materyali olduğunu gösteriyoruz <sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği’nden (JSPS) Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (KAKENHI) ile desteklenmiştir. JP19K10259 ve 22K10032’den MAI’ye).

Materials

0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
  4. Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
  5. Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  6. Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
  7. Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9 (2007).
  8. Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host’s vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
  9. Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues–the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
  10. Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
  11. Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
  12. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  13. Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
  14. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  15. Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
  16. Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
  17. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  18. Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
  19. van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
  20. Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
  21. Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
  22. Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
  23. Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
  24. Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
  25. Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
  26. Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
  27. Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
  28. Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
  29. Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
  30. Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
  31. Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton’s jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
  32. Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
  33. Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
  34. Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
  35. La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
  36. Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O’Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
  37. Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
  38. Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
  39. Zarembinski, T., Skardal, A. . Hydrogels – Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
  40. Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
  41. Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
  42. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  43. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  44. Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
  45. Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
  46. Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
  47. Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
  48. Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).

Tags

Mesenchymal Stem CellsBone FormationIn VivoEndochondral OssificationArtificial CartilageBone RegenerationAngiogenesisScaffoldCartilage DifferentiationCritical Size Bone DefectECO-mediated Approach
check_url/kr/65573?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image