Method Article

Density Gradient Centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제

DOI:

10.3791/65574

⸱

September 1st, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 밀도 구배 원심분리(DGC)를 통해 인간의 대변에서 농축된 박테리아 세포외 소포체(BEV)를 분리 및 정제하는 방법을 설명하고, 형태, 입자 크기 및 농도에서 BEV의 물리적 특성을 식별하고, 임상 및 과학 연구에서 DGC 접근 방식의 잠재적 응용 분야에 대해 논의합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

박테리아 세포외 소포체(BEV)는 박테리아-박테리아 및 박테리아-숙주 통신에 적극적인 역할을 하는 박테리아에서 파생된 나노소포체로, 모체 박테리아에서 물려받은 단백질, 지질 및 핵산과 같은 생체 활성 분자를 전달합니다. 장내 미생물군에서 유래한 BEV는 위장관 내에서 영향을 미치고 멀리 떨어진 장기에 도달할 수 있어 생리학 및 병리학에 상당한 영향을 미칩니다. 인간의 대변에서 유래한 BEV의 유형, 수량 및 역할을 탐구하는 이론적 연구는 장내 미생물군에서 BEV의 분비와 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이러한 조사는 또한 BEV를 분리하고 정제하기 위한 현재 전략의 개선을 필요로 합니다.

이 연구는 하향식(Top-down)과 상향식(Bottom-up)의 두 가지 밀도 구배 원심분리(DGC) 모드를 설정하여 BEV의 분리 및 정제 프로세스를 최적화했습니다. BEV의 농축 분포는 분획 6 내지 8(F6-F8)로 결정하였다. 접근법의 효과는 입자 형태, 크기, 농도 및 단백질 함량을 기반으로 평가되었습니다. 입자 및 단백질 회수율을 계산하고 특정 마커의 존재를 분석하여 두 DGC 모드의 회수율과 순도를 비교했습니다. 그 결과 하향식 원심분리 모드는 오염 수준이 낮고 상향식 모드와 유사한 회수율과 순도를 달성한 것으로 나타났습니다. 7시간의 원심분리 시간은 108/mg의 분변 BEV 농도를 달성하기에 충분했습니다.

대변 외에도 이 방법은 성분과 점도의 차이에 따라 적절하게 수정하여 다른 체액 유형에 적용할 수 있습니다. 결론적으로, 이 상세하고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 BEV의 표준화된 분리 및 정제를 용이하게 하여 후속 다중 오믹스 분석 및 기능 실험을 위한 토대를 마련할 것입니다.

Introduction

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소화관은 인체에서 가장 풍부한 미생물 군집을 보유한 기관으로 널리 알려져 있으며, 박테리아의 90% 이상이 집락 형성 및 증식에 관여합니다 1,2. 장내 미생물총(microbiota)이 장내 미세환경을 조절하고 동시에 주로 손상된 장 장벽(intestal barrier)을 통해 멀리 떨어진 장기의 기능 장애와 상호 작용한다는 광범위한 증거가 입증되었습니다 3,4. 장내 미생물군의 불균형과 염증성 장 질환(IBD)5,6 및 장-뇌 축 을 통한 인지 장애(5,6,7,8)의 진행 사이에 상관관계가 있다는 증거가 늘어나고 있습니다. 박테리아에 의해 생성되는 박테리아 세포외 소포체(BEV)는 이러한 병리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.

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Protocol

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남방의과대학 난팡병원 윤리위원회는 참가자들의 사전 동의 하에 진행된 이 연구를 승인했다. 여기에 사용된 모든 방법은 국제 인간 마이크로바이옴 표준(IHMS: http://www.microbiome-standards.org/)에서 제공하는 표준 운영 지침을 준수했습니다. 이후의 모든 액체 취급 절차는 생물 안전 캐비닛 또는 매우 깨끗한 벤치 내에서 수행되어야 했습니다.

1. 분변 샘플의 채취 및 분취

  1. 대변 샘플러, 밀봉된 백, 아이스 박스를 배포하고 참가자들에게 샘플을 조달하고 보존하는 방법에 대한 포괄적인 지침을 제공합니다.
  2. 각 참가자에게 제공된 샘플러를 사용하여 대변 샘플을 수집하고 24시간 이내에 4°C의 온도로 실험실로 운송하도록 지시합니다.
  3. 실험실에서 수령하면 멸균 스푼을 사용하여 3.5g 미만의 대변을 미리 칭량된 50mL 원심분리 튜브에 분주합니다. 후속 전처리 절차를 위해 튜브에 대변 샘플의 무게를 기록합니다.
    일시 중지 지점: 샘플을 즉시 처리할 수 없는 경우 적절한 표기 후 -80°C에서 장기 보관을 위해 샘플을 할당합니다.

2. 대변 시료 전처리

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BEV 농축 분획의 분포 결정
박테리아 세포외 소포체(BEV)-농축 분획물의 분포를 결정하기 위해, OD 340nm에서 흡광도 값을 측정하기 위해 블랭크 대조군을 설정하고, 측정 및 요오드화놀 가이드라인을 기반으로 각 분획의 밀도를 계산하였다(단계 8.1). 표 2 는 밀도 결과를 제시하며, 분획 F4 내지 F9가 전형적으로 세포외 소포체와 관련된 범위 내에서 밀도를 나타낸다는 것을 보여줍니다. 이 발견은 대부분의 BEV가 이러한 분획에서 분리되어 F4-F9를 BEV의 대략적인 범위로 정의했음을 시사합니다. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 그림 1 에서 분획 F4-F9로 표시된 것처럼 분리된 분변 BEV의 형태학적 특징을 특성화했습니다. TEM 이미지(그림 2)는 BEV의 특징인 고전적인 컵 모양의 구조의 존재를 보여주었습니다. 나노 입자 추적 분석(N.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

박테리아 세포외 소포체(BEV)는 박테리아가 분비하는 지질-이중층 나노입자로, 풍부한 단백질, 지질, 핵산 및 기타 생체 활성 분자를 운반하여 박테리아20의 기능적 효과를 매개하는 데 기여합니다. 장에서 유래한 BEV는 염증성 장 질환, 크론병, 대장암과 같은 질병의 발병에 관여하고 일반적인 대사에 영향을 미치고 인지 기능 장애를 중재하는 것으로 확인되었습니다 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 <.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언한다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 저명한 젊은 학자를 위한 국립 과학 기금(National Science Fund for Distinguished Young Scholars, 82025024)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 (82230080)의 핵심 프로젝트; 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2021YFA1300604); 중국 국립 자연 과학 재단 (81871735, 82272438 및 82002245); 저명한 젊은 학자를 위한 광둥성 자연과학 기금(2023B1515020058); 광둥성 자연과학재단(2021A1515011639); 중국 산둥성 자연과학재단의 주요 국가 기초 연구 개발 프로그램(ZR2020ZD11); 박사후 과학 재단(2022M720059); 남부 의과 대학 Nanfang 병원의 뛰어난 청소년 개발 계획(2022J001).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 % (w/v) 글루타르알데히드(탈이온수 내 2.5% 원액으로 제조)ACMECAP11268.3.3단계에서 TEM을 사용한 BEV에 대한 형태학적 관찰
1%(w/v) 메틸셀룰로오스(탈이온수 내 원래 분말로 준비)Sigma-AldrichM70278.3.6단계에서 TEM을 사용한 BEV에 대한 형태학적 관찰
1.5%(w/v) 우라닐 아세테이트(탈이온수 내 원래 분말로 준비)Polysciences21447-258.3.5 단계에서 TEM을 사용한 BEV에 대한 형태학적 관찰
1000 μ L, 200 &뮤; L, 10 &뮤; L 피펫KIRGENKG1313, KG1212, KG1011용액
5 % (w / v) 소 혈청 알부민 용액 (TBST 완충액의 원래 분말에서 준비)Fdbio scienceFD00308.5.6 단계 5 ×에서 차단을 위해 웨스턴 블로팅에 사용
; 로딩 버퍼Fdbio scienceFD0068.5.1 단계에서 웨스턴 블로팅 및 Coomassie 브릴리언트 블루 염색에 사용
75 % (v / v) 알코올LIRCONLIRCON-500 mL표면 소독
96-웰 플레이트RarA8096흡광도 값을 측정합니다 
Anti-Calnexin 항체Abcamab92573Western blotting (Primary 항체)
Anti-CD63 항체Abcamab134045Western blotting (1차 항체)
Anti-CD9 항체Abcamab236630Western blotting (1차 항체)
Anti-Flagellin 항체Sino Biological40067-MM06Western blotting (1차 항체)
Anti-Integrin beta 1 항체Abcamab30394Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibodyThermo FisherMA1-83152Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibodyThermo Fisher MA1-7402웨스턴 블로팅 (1차 항체)
안티-옴피 항체CUSABIOCSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/웨스턴 블로팅 (1차 항체)
안티 신테닌 항체Abcamab133267웨스턴 블로팅 (1차 항체)
Anti-TSG101 항체Abcamab125011웨스턴 블로팅 (1차 항체)
오토클레이브ZEALWAYGR110DP실험에 사용된 공급 및 매체에 대한 살균
BalanceMettler ToledoAL104로 샘플이 로드된 튜브의 균형을 맞추십시오
.Fdbio 과학FD20018.2 단계에서 BEV의 단백질 함량을 측정
생물 안전 캐비닛HaierHR1200- II B2Peform
에서 보인 BEV 격리 및 정제의 개략도 작업 흐름을 대
원심 분리기 5810 R에 대한 절차를 확인하십시오. Rotor F-34-6-38Eppendorf5805000092; 5804727002, 어댑터: 5804774000BEV를 위한 전처리 (단계 3)
화학발광 장치BIO-OIOI600SE-MF단계 8.5.12에서 신호 감지를 위한 웨스턴 블로팅에 사용
Cytation 5BioTekF01흡광도(단계 8.1) 및 형광(그림 6) 값을 측정하기 위한 마이크로플레이트 검출기 
Dil-labled 저밀도 지단백질ACMECAC12038간섭 성분의 분포 정의 
전기영동 장비Bio-rad16580338.5.2, 8.5.3, 8.5.5 단계에서 단백질 분리 및 전달을 위한 웨스턴 블로팅에 사용됩니다
향상된 화학발광 키트 HRP Fdbio 과학FD8020단계에서 신호 감지를 위한 웨스턴 블로팅에 사용됩니다
Escherichia coli  American Type Culture CollectionATCC8739BEV를 양성 대조군으로 분리합니다. 프로토콜: LB 분말 25g을 1L 탈이온수에 녹이고 오토클레이브합니다. 800 &mu를 전송합니다. L은 배지에 보존 된 Escherichia coli를 사용합니다. 37 °에서 재배하십시오. C를 인큐베이터 셰이커에 넣습니다. 그 때 3, 000 ×에 분리기; g 4°C에서 20분 동안; C, 12, 000 &회; g 4°C에서 30분 동안; C, 0.22 &mu를 통해 상등액을 필터링합니다. M 막은, 160, 000 ×에 초고속 원심분리를 실행합니다; g 4°C에서 70분 동안 &C. 대장균의 조잡한 BEV로 정의된 펠렛을 1.2mL PBS에 현탁시켰습니다(3, 4단계).      
Falcon 튜브 50 mLKIRGENKG2811BEVs (Step 3)
Feto 단백질 염색 버퍼Absciab.001.50Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paperBiosharpBS-TFP-070BMorphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids Sigma-AldrichTEM-FCF200CU508.3단계에서 TEM을 사용한 BEV에 대한 형태학적 관찰
Hepes 분말MeilunbioMB6078밀도 구배 원심분리를 위한 다양한 농도의 요오딕산올 완충액 준비
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Fdbio scienceFDM007Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Fdbio 과학FDR007웨스턴 블로팅 (보조 항체)
인큐베이터 쉐이커QiangwenDHZ-L배양 대장균 
킴와이프스&트레이드; 섬세한 작업 닦음Kimtech Science34155단계에서 초원심분리기 튜브의 내벽을 닦습니다. 4.15
LB 수프HopebioHB0128배양 대장균 
저온 냉동고 (-80 ° C)HaierDW-86L338J샘플 저장
메탄올AlalddinM116118단계에서 PVDF 멤브레인을 활성화하기 위해 웨스턴 블로팅에 사용
마이크로 튜브 1.5mLKIRGENKG2211밀도 구배 원심분리 후 분획 회수
마이크로 튜브 2mLKIRGENKG2911밀도 구배 원심분리 후 분획 회수
Micro 튜브 5 mLBBIF610888-0001밀도 구배 원심분리 후 분획 회수
마이크로플레이트 리더 써모 피셔 Multiskan MK38.2 단계에서 BEV의 단백질 함량 측정
Millipore 필터 0.22 μ mMerck 밀리포어SLGP033RB여과 살균; 재질 : 폴리 에테르 설폰, PES
NaClGHTECH1.01307.040밀도 구배 원심 분리 용액
NaOHGHTECH1.01394.068밀도 구배 원심 분리 용액 (pH 조정)
Optima ™ XPN-100Beckman CoulterA944694, 7단계에서 BEV 분리를 위한 초원심분리
OptiPrep™Serumwerk Bernburg AG1893밀도 구배 원심 분리 원액
Orbital ShakerYouningCS-1002 단계에서 대변 용해
인산염 완충 식염수ProcellPB1803272 단계에서 대변 용해
피펫터Eppendorf3120000267, 3120000259용액 이송
플라스틱 파스퇴르 피펫ABCbioABC217003-4단계에서 전처리 시 상등액 제거 3.4
폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막MilliporeISEQ00010, IPVH000108.5.5 단계에서 단백질 전달을 위한 웨스턴 블로팅에 사용
사전 제작된 폴리아크릴아미드 겔, 4– 20% 15 WellsACEF15420Gel8.5.2, 8.5.3단계에서 단백질 분리를 위한 웨스턴 블로팅에 사용
차 항체 희석제Fdbio scienceFD00408.5.8단계에서 웨스턴 블로팅에 사용
단백질 사다리Fdbio scienceFD06728.5단계에서 웨스턴 블로팅 및 Coomassie brilliant blue stain에 사용
빠른 단백질 블로팅 용액UBIOUW05008.5.5단계에서 단백질 전달을 위한 웨스턴 블로팅에 사용됨
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter369650초원심분리는 Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL에서JetwayZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL전송 버퍼는 TBS 분말을 사전 처리하면서 상층액을 제거합니다
Fdbio scienceFD1021Hitachi에서 웨스턴 블로팅에 사용됩니다
.H-76508.3단계에서 BEV에 대한 형태학적 관찰
Tween-20Fdbio 과학FD00208.5단계에서 웨스턴 블로팅에 사용
초원심분리기 튜브Beckman326823, 3556424, 7단계에서 BEV 격리를 위한 초원심분리
울트라클린 벤치AIRTECHSW-CJ-2FD에 대한 절차 수행
CU6008.2.5단계에서 BEV의 단백질 함량 측정에 사용됨
ZetaViewParticle MetrixS/N 21-734, 소프트웨어 ZetaView(버전 8.05.14 SP7)8.4단계에서 BEV의 입자 크기 및 농도를 측정하기 위한 나노 입자 추적 분석(NTA)
PBS Bicinchoninic acid assay하십시오 BioRender https://app.biorender.com 그림 1 변 샘플 처리 . 1 BEVs 분리를 위한 것입니다.. 은 8.5단계 투과전자현미경 (TEM) 액체 취급 수조 Bluepard

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  2. Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in healt....

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