Intradermal mikrodialys: Ett tillvägagångssätt för att undersöka nya mekanismer för mikrovaskulär dysfunktion hos människor

Summary

Intradermal mikrodialys är en minimalinvasiv teknik som används för att undersöka mikrovaskulär funktion vid hälsa och sjukdom. Både dos-respons och lokala uppvärmningsprotokoll kan användas för denna teknik för att utforska mekanismer för vasodilatation och vasokonstriktion i den kutana cirkulationen.

Abstract

Den kutana vaskulaturen är en tillgänglig vävnad som kan användas för att bedöma mikrovaskulär funktion hos människor. Intradermal mikrodialys är en minimalinvasiv teknik som används för att undersöka mekanismer för vaskulär glatt muskulatur och endotelfunktion i den kutana cirkulationen. Denna teknik möjliggör farmakologisk dissektion av patofysiologin för mikrovaskulär endotelial dysfunktion som indexeras av minskad kväveoxidmedierad vasodilatation, en indikator på risk för utveckling av kardiovaskulär sjukdom. I denna teknik placeras en mikrodialyssond i hudens dermala lager och en lokal värmeenhet med en laserdopplerflödessond placeras över sonden för att mäta flödet av röda blodkroppar. Den lokala hudtemperaturen kläms fast eller stimuleras med direkt värmeapplicering, och farmakologiska medel perfunderas genom sonden för att stimulera eller hämma intracellulära signalvägar för att inducera vasodilatation eller vasokonstriktion eller för att undersöka mekanismer av intresse (co-faktorer, antioxidanter, etc.). Den kutana vaskulära konduktansen kvantifieras och mekanismer för endotelial dysfunktion i sjukdomstillstånd kan avgränsas.

Introduction

Kardiovaskulär sjukdom (CVD) är den vanligaste dödsorsaken i USA¹. Hypertoni (HTN) är en oberoende riskfaktor för stroke, kranskärlssjukdom och hjärtsvikt och beräknas drabba upp till ~50 % av USA:s befolkning². HTN kan utvecklas som en oberoende kardiovaskulär sjukdom (primär HTN) eller som ett resultat av ett annat tillstånd, t.ex. polycystisk njursjukdom och/eller endokrina störningar (sekundär HTN). Bredden av etiologier för HTN komplicerar undersökningar av de underliggande mekanismerna och skador på slutorganen som observerats med HTN. Det behövs mångsidiga och nya forskningsmetoder för patofysiologin hos de skador på slutorganen som är förknippade med HTN.

Ett av de tidigaste patologiska tecknen på CVD är endoteldysfunktion, som kännetecknas av nedsatt kväveoxid (NO)-medierad vasodilatation ^3,4,5. Flödesmedierad dilatation är ett vanligt tillvägagångssätt som används för att kvantifiera endoteldysfunktionen i samband med CVD, men endoteldysfunktion i mikrovaskulära bäddar kan vara både oberoende av och föregångare till den hos stora ledningsartärer ^6,7,8. Dessutom påverkas resistensarterioler mer direkt av lokal vävnad än ledningsartärer och har mer omedelbar kontroll över leveransen av syrerikt blod. Mikrovaskulär funktion är prediktiv för överlevnad utan kardiovaskulära händelser ^9,10,11. Den kutana mikrovaskulaturen är en tillgänglig kärlbädd som kan användas för att undersöka svar på fysiologiska och farmakologiska vasokonstriktiva eller vasodilaterande stimuli. Intradermal mikrodialys är en minimalinvasiv teknik, vars mål är att undersöka mekanismerna för både vaskulär glatt muskulatur och endotelfunktion i den kutana mikrovaskulaturen med riktad farmakologisk dissektion. Denna metod står i kontrast till andra tekniker, såsom postocklusiv reaktiv hyperemi, som inte tillåter farmakologisk dissektion, och jontofores, som möjliggör farmakologisk tillförsel men är mindre exakt i sin verkningsmekanism (granskad noggrant på annat håll¹²).

Logiken bakom utvecklingen och användningen av denna teknik granskas utförligt på annat håll¹³. Detta tillvägagångssätt utvecklades ursprungligen för användning i neurologisk forskning på gnagare och tillämpades sedan först på människor för att undersöka mekanismerna bakom aktiv vasodilatation ur en termoregulatorisk synvinkel. I slutet av 1990-talet användes denna metod för att undersöka både neurala och endotelmekanismer med avseende på lokal uppvärmning av huden. Sedan dess har tekniken använts för att undersöka ett antal neurovaskulära signalmekanismer i huden.

Med hjälp av denna teknik har vår grupp och andra undersökt mekanismerna för endoteldysfunktion i mikrovaskulaturen hos flera kliniska populationer, inklusive, men inte begränsat till, dyslipidemi, primärt åldrande, diabetes, kronisk njursjukdom, polycystiskt ovariesyndrom, havandeskapsförgiftning, egentlig depression 14,15,16,17,18,19 och hypertoni ^20,21,22,23,24. Till exempel fann en tidigare studie att normotensiva kvinnor med en historia av havandeskapsförgiftning, som löper en ökad risk för hjärt-kärlsjukdom, hade minskad NO-medierad vasodilatation i den kutana cirkulationen jämfört med kvinnor med en historia av normotensiv graviditet²⁰. I en annan studie visade vuxna som diagnostiserats med primär HTN ökad angiotensin II-känslighet i mikrovaskulaturen jämfört med friska kontroller²¹, och kronisk sulfhydryldonerande blodtryckssänkande läkemedelsbehandling hos patienter med primär HTN har visat sig sänka blodtrycket och förbättra både vätesulfid- och NO-medierad vasodilatation²². Wong et ^al.23 fann försämrad sensoriskt medierad och NO-medierad vasodilatation hos prehypertensiva vuxna, vilket sammanföll med vårt fynd av en progression av endotelial dysfunktion med ökande HTN-stadier, som kategoriseras av 2017 American Heart Association och American College of Cardiology riktlinjer²⁴.

Den intradermala mikrodialystekniken möjliggör noggrant kontrollerade mekanistiska undersökningar av mikrovaskulär funktion i hälso- och sjukdomstillstånd. Därför syftar denna uppsats till att beskriva den intradermala mikrodialystekniken som tillämpas av vår grupp och andra. Vi beskriver procedurerna för både farmakologisk stimulering av endotelet med acetylkolin (ACh) för att undersöka dos-responsförhållandet och fysiologisk stimulering av endogen NO-produktion med antingen ett 39 °C eller 42 °C lokalt uppvärmningsstimulusprotokoll. Vi presenterar representativa resultat för varje metod och diskuterar de kliniska implikationerna av de fynd som har uppstått från denna teknik.

Protocol

Alla procedurer godkänns av Institutional Review Board vid Pennsylvania State University före rekrytering av deltagare. 1. Inställning av utrustning Slå på den lokala värmeenheten och laserdopplerflödesmätaren.OBS: Båda bör kalibreras före datainsamling enligt tillverkarens instruktioner. Laserdopplerflödesmätaren ska anslutas till datainsamlingshårdvara med sampling vid 100 Hz (100 samples/min) och kontinuerlig registrering i en datainsamlingsprogramvara. Även om …

Representative Results

Dos-responsprotokoll för acetylkolin Figur 1A visar ett schema som beskriver ACh-dos-responsprotokollet. Figur 1B illustrerar representativa tracings av RBC-flödesvärdena (perfusionsenheter, PU; 30 s medelvärden) från det standardiserade ACh-dos-responsprotokollet för en patient över tid. Figur 1C illustrerar en rådatafil för ett ACh-dos-responsprotokoll. Ytterligare baslinjemät…

Discussion

Den intradermala mikrodialystekniken är ett mångsidigt verktyg inom humankärlsforskning. Utredare kan ändra protokollet för att ytterligare diversifiera dess tillämpningar. Till exempel beskriver vi ett ACh-dos-responsprotokoll, men andra undersökningar av mekanismerna för vasokonstriktion eller vasomotorisk tonus, snarare än enbart vasodilatation, har använt noradrenalin eller natriumnitroprussid dos-responsmetoder 26,27,28,29,30,31.<sup cla…

Materials

1 mL syringes	BD Syringes	302100
Acetlycholine	United States Pharmacopeia	1424511	Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator
Alcohol swabs	Mckesson	191089
Baby Bee Syringe Drive	Bioanalytical Systems, Incorporated	MD-1001	In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized
CMA 30 Linear Microdialysis Probes	Harvard Apparatus	CMA8010460
Connex Spot Monitor	WelchAllyn	74CT-B	automated blood pressure monitor
Hive Syringe Pump Controller	Bioanalytical Systems, Incorporated	MD-1020	Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives
LabChart 8	AD Instruments		**PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions
Lactated Ringer's Solution	Avantor (VWR)	76313-478
Laser Doppler Blood FlowMeter	Moor Instruments	MoorVMS-LDF
Laser Doppler probe calibration kit	Moor Instruments	CAL
Laser Doppler VP12 probe	Moor Instruments	VP12
Linear Microdialysis Probes	Bioanalytical Systems, Inc.	MD-2000
NG-nitro-l-arginine methyl ester	Sigma Aldrich	483125-M	L-NAME
Povidone-iodine / betadine	Dynarex	1202
PowerLab C Data Acquisition Device	AD Instruments	PLC01	**
PowerLab C Instrument Interface	AD Instruments	PLCI1	**
Probe adhesive discs	Moor Instruments		attach local heating unit to skin
Skin Heater Controller	Moor Instruments	moorVMS-HEAT 1.3
Small heating probe	Moor Instruments	VHP2
Sterile drapes	Halyard	89731
Sterile gauze	Dukal Corporation	2085
Sterile surgical gloves	Esteem Cardinal Health	8856N	catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium)
Surgical scissors	Cole-Parmer	UX-06287-26