Denne protokollen beskriver en metode for å indusere en nøyaktig og reproduserbar hornhinne- og limbal alkaliskade i en musemodell. Protokollen er fordelaktig da den muliggjør en jevnt fordelt skade på den høyt buede musehornhinnen og limbus.
Hornhinnen er kritisk for syn, og hornhindeheling etter traumer er grunnleggende for å opprettholde sin gjennomsiktighet og funksjon. Gjennom studiet av hornhindeskademodeller tar forskerne sikte på å forbedre forståelsen av hvordan hornhinnen helbreder og utvikle strategier for å forebygge og håndtere hornhindeopasiteter. Kjemisk skade er en av de mest populære skademodellene som har blitt grundig studert på mus. De fleste tidligere etterforskere har brukt et flatt papir dynket i natriumhydroksid for å indusere hornhinneskade. Imidlertid er indusering av hornhinne- og limbalskade ved bruk av flatt filterpapir upålitelig, siden musehornhinnen er svært buet. Her presenterer vi et nytt instrument, en modifisert biopsistans, som gjør det mulig for forskerne å skape en godt begrenset, lokalisert og jevnt fordelt alkaliskade på murine hornhinnen og limbus. Denne punch-trephine-metoden gjør det mulig for forskere å indusere en nøyaktig og reproduserbar kjemisk brenning til hele murine hornhinnen og limbus, mens de forlater andre strukturer, som øyelokkene, upåvirket av kjemikaliet. Videre introduserer denne studien en enukleasjonsteknikk som bevarer den mediale karunkelen som et landemerke for å identifisere nesesiden av kloden. Bulbar og palpebral conjunctiva og lacrimal kjertel holdes også intakt ved hjelp av denne teknikken. Oftalmologiske undersøkelser ble utført med spaltelampebiomikroskop og fluoresceinfarging dag 0, 1, 2, 6, 8 og 14 etter skaden. Kliniske, histologiske, og immunhistokjemiske funn bekreftet limbal stamcellemangel og okulær overflateregenereringssvikt hos alle eksperimentelle mus. Den presenterte alkaliske hornhinneskademodellen er ideell for å studere limbal stamcellemangel, hornhinnebetennelse og fibrose. Denne metoden er også egnet for å undersøke prekliniske og kliniske effekter av aktuelle oftalmologiske medisiner på murine hornhinnen.
Hornhinnen er kritisk for syn og viser unike egenskaper, inkludert gjennomsiktighet, som er en forutsetning for klar visjon. I tillegg til å tjene en viktig beskyttende rolle, står hornhinnen for 2/3 av brytningskraften i øyet1. På grunn av sin betydelige rolle i synet, forårsaker hornhinneskader og opasitet betydelig visuell nedgang og er ansvarlig for den nest høyeste årsaken til forebyggbar blindhet over hele verden 2,3. Ved hornhinneskader med alvorlig limbal dysfunksjon reduseres barrierefunksjonen til limbus, noe som resulterer i migrasjon av konjunktivceller mot hornhinnens overflate og hornhindekonjunktivalisering 4,5, noe som kompromitterer visjonen dramatisk. Effektive forebyggende og terapeutiske strategier er derfor nødvendig for å takle den globale byrden av hornhindeblindhet og relatert funksjonshemming.
Den nåværende forståelsen av den menneskelige hornhinnen sårhelingsprosessen er basert på tidligere studier som har undersøkt hornhinnerespons på ulike skader. Flere teknikker og dyremodeller har blitt brukt for å indusere ulike kjemiske eller mekaniske hornhinneskader 6,7,8,9 og for å undersøke ulike aspekter av hornhinnen sårhelingsprosessen.
Alkalibrenningsmodellen er en veletablert skademodell som utføres ved å påføre natriumhydroksid (NaOH) direkte over hornhinnens overflate eller ved å bruke flatt filterpapir10. En alkaliskade resulterer i frigjøring av proinflammatoriske mediatorer og infiltrering av polymorfonukleære celler, ikke bare i hornhinnen og øyets fremre kammer, men også i netthinnen. Dette induserer utilsiktet retinal ganglioncelleapoptose og CD45+ celleaktivering11. Derfor er det viktig å lokalisere skadestedet nøyaktig for å unngå overdreven utilsiktet skade ved hjelp av en alkaliskademodell.
Den aksiale lengden på murine øyebollet er ca. 3 mm12. På grunn av denne korte avstanden mellom hornhinnen og netthinnen, eksisterer en bratt hornhinnekurvatur for å gi høy brytningskraft for å fokusere lyset på netthinnen (figur 1A). Som vi tidligere har rapportert13, er det vanskelig å indusere kjemisk skade på denne svært buede overflaten ved hjelp av et flatt filterpapir, spesielt ved limbus (figur 1B). Å indusere skade på limbus krever å vippe filterpapiret, som har potensial til å forårsake utilsiktet skade på fornix og tilstøtende bindehinne14. En annen tilnærming innebærer direkte påføring av kjemisk middel som dråper på hornhinnen. Denne metoden mangler imidlertid kontroll over eksponeringstiden, og det er en potensiell risiko for å forårsake skade på bindehinden, fornix og øyelokkene på grunn av diffusjon av væsken til disse områdene.
For å overvinne disse begrensningene, presenterer denne studien en ny punch-trephine metode for å indusere skade. Denne teknikken har flere fordeler, inkludert (i) å indusere en effektiv kjemisk skade på hele hornhinnens overflate og limbus i musemodell, (ii) indusere en lokalisert og godt omskrevet skade på hornhinnen, (iii) evnen til å påføre væske av interesse for en forhåndsbestemt varighet, og (iv) evnen til å indusere forskjellige størrelser av hornhinneskader ved å velge passende biopsistanser. Denne metoden er også mulig for rotte- og kaninskademodeller, som også viser en buet hornhinneoverflate og er vanlige dyremodeller som brukes til å studere sårheling av okulær overflate.
Denne studien foreslår en innovativ enhet, punch-trephine, som kan brukes til å indusere en effektiv og reproduserbar hornhinne- og limbal skade i en musemodell. Denne limbale stamcellemangelmodellen er ideell for å undersøke dynamikken i hornhinnen sårheling og konjunktivalisering etter skade.
Bevis tyder på at både limbal nisje og sentral del av murine hornhinnen inneholder stamceller30. Derfor er det nødvendig med en effektiv hornhinne- og limbalskade for å produsere en stamcellemangelmodell, og skademodellen som presenteres her muliggjør eksponering av den buede hornhinnelimbus til et kjemisk middel i en bestemt periode. For å bestemme den beste konsentrasjonen og varigheten av NaOH-skaden, ble det påført skader med ulike NaOH-konsentrasjoner og varigheter. Høyere NaOH-konsentrasjoner eller lengre eksponeringsvarighet resulterte i økt vevsskade og fibrose. Derfor kan forskere justere disse parametrene basert på de spesifikke målene for studien og ønsket alvorlighetsgrad av skade.
For å lykkes med å reprodusere denne hornhinne- og limbalskademodellen, bør flere viktige hensyn vurderes. For det første er det viktig å måle limbal-til-limbal diameter av det målrettede øyet for å bestemme riktig størrelse på stansen. Det anbefales å velge en biopsistans med en ytre diameter som er 0,5 – 1 mm større enn denne diameteren.
Overflatespenningen til væsken som brukes er en viktig faktor for å forhindre lekkasje i grenseflaten mellom den okulære overflaten og kanten av stansetrefinet som vist i figur 1G. Derfor er det ikke nødvendig å legge press på spissen av stansebiopsien.
For å unngå å forårsake mekanisk skade på vevet, er det viktig å holde stansen trefin i en parallell akse med øyet og avstå fra å legge press på limbus. Feil justering av hulltrefilaksen kan øke risikoen for lekkasje og resultere i et ødelagt skadested og unøyaktige resultater.
Noen potensielle begrensninger av denne teknikken inkluderer behovet for å velge riktig stansestørrelse, skaffe seg ferdigheter i å holde punch trefin, og den potensielle risikoen for å forårsake mekanisk skade. Disse begrensningene kan imidlertid overvinnes gjennom praksis og ved å følge instruksjonene som er beskrevet i denne protokollen. Stammen og aldersgruppen til musene er andre faktorer som påvirker reepitelialiseringsprosessen og må vurderes i studien.
Videre er den foreslåtte protokollen fordelaktig da den beskriver en enukleasjonsmetode som bevarer bulbar og palpebral conjunctiva og muliggjør bestemmelse av nesedelen av kloden uten anvendelse av kirurgiske suturer som markør. Tidligere forskning har indikert at neseområdet i øyet har den laveste nevrale innerveringen sammenlignet med andre områder av hornhinnen, noe som gjør den mer utsatt for neovaskularisering og redusert regenerativ effekt31,32.
Oppsummert bekrefter de kliniske tegnene på LSCD, som hornhindefortetning (CO), vedvarende epiteldefekter og hornhinde-neovaskularisering (NV), sammen med de observerte histologiske endringene, inkludert begercellemetaplasi, ekspresjon av K13 på hornhinnen, og fravær av K12 på hornhinnen, tilstedeværelsen av LSCD i denne modellen. Disse funnene gir bevis på at denne nye teknikken er effektiv i å indusere LSCD. Denne kjemiske skademodellen kan brukes i prekliniske studier for å undersøke nye medisiner og farmasøytiske behandlinger innen hornhinneskade og regenerering.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner at NEI P30-EY026877 støtter denne forskningen. Vi anerkjenner Charlene Wang og Dr. Irv Weissman Lab ved Stanford University’s Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine for all deres vennlige hjelp til å gi eksperimentelle dyr. Vi setter pris på Hirad Rezaeipoors hjelp til utarbeidelse og redigering av bildene.
Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
Curved forceps | Storz | E1885 | |
Disposable 90 degree bent needle | |||
Disposable biopsy punch | Med blades | ||
Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
Heating pad for mouse | |||
Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
Ophthalmic surgical scissors | |||
pH Indicator Sticks | Whatman | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
Timer | |||
Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |