Questo studio fornisce un protocollo per l’utilizzo di topi knockout Stat3 inducibili specifici per il lignaggio osteoblastico per studiare il rimodellamento osseo sotto la forza ortodontica e descrive i metodi per analizzare il rimodellamento dell’osso alveolare durante il movimento ortodontico dei denti, facendo così luce sulla biologia meccanica scheletrica.
L’osso alveolare, con un alto tasso di turnover, è l’osso più attivamente rimodellante del corpo. Il movimento ortodontico dei denti (OTM) è un processo artificiale comune di rimodellamento dell’osso alveolare in risposta alla forza meccanica, ma il meccanismo sottostante rimane sfuggente. Studi precedenti non sono stati in grado di rivelare il meccanismo preciso del rimodellamento osseo in qualsiasi tempo e spazio a causa delle restrizioni relative al modello animale. Il trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3) è importante nel metabolismo osseo, ma il suo ruolo negli osteoblasti durante l’OTM non è chiaro. Per fornire prove in vivo che STAT3 partecipa all’OTM in punti temporali specifici e in particolari cellule durante l’OTM, abbiamo generato un modello murino knockout Stat3 specifico per il lignaggio osteoblastico inducibile dal tamoxifene, applicato la forza ortodontica e analizzato il fenotipo dell’osso alveolare.
La tomografia microcomputerizzata (Micro-CT) e la stereomicroscopia sono state utilizzate per accedere alla distanza OTM. L’analisi istologica ha selezionato l’area situata all’interno di tre radici del primo molare (M1) nella sezione trasversale dell’osso mascellare come regione di interesse (ROI) per valutare l’attività metabolica degli osteoblasti e degli osteoclasti, indicando l’effetto della forza ortodontica sull’osso alveolare. In breve, forniamo un protocollo per l’utilizzo di topi knockout Stat3 inducibili per il lignaggio osteoblastico specifico per studiare il rimodellamento osseo sotto forza ortodontica e descrivere metodi per analizzare il rimodellamento osseo alveolare durante l’OTM, gettando così nuova luce sulla biologia meccanica scheletrica.
È generalmente noto che l’osso è sottoposto a costante ricostruzione per tutta la vita, in risposta a forze meccaniche secondo la legge di Wolff 1,2. Un’adeguata stimolazione meccanica, come la gravità e l’esercizio quotidiano, mantiene la massa ossea e la forza e previene la perdita ossea stimolando sia gli osteoblasti che gli osteoclasti. Gli osteoclasti, responsabili del riassorbimento osseo 3,4,5,6,7, e gli osteoblasti, responsabili della formazione ossea 8,9,10, mantengono l’omeostasi ossea e funzionano congiuntamente nel processo biologico di rimodellamento osseo. Al contrario, in assenza di stimoli di carico, come negli astronauti in condizioni di microgravità a lungo termine, le ossa subiscono una perdita di densità minerale ossea del 10%, aumentando così il rischio di osteoporosi11,12. Inoltre, le terapie meccaniche non invasive e convenienti, tra cui l’ortodonzia e l’osteogenesi da distrazione, sono emerse come trattamenti per le malattie ossee13,14. Tutto ciò ha dimostrato che la forza meccanica svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della qualità e della quantità dell’osso. Studi recenti hanno generalmente analizzato il rimodellamento osseo in risposta al carico meccanico utilizzando modelli che richiedono molto tempo come i test di sospensione della ruota e della coda, che di solito richiedevano 4 settimane o più per simulare il carico o lo scarico della forza15,16. Pertanto, c’è richiesta di un modello animale conveniente ed efficiente per lo studio del rimodellamento osseo guidato dal carico di forza.
L’osso alveolare è il più attivo in termini di rimodellamento osseo, con un alto tasso di turnover17. Il movimento ortodontico dei denti (OTM), un trattamento comune per la malocclusione, è un processo artificiale di rimodellamento dell’osso alveolare in risposta alla forza meccanica. Tuttavia, l’OTM, che induce un rapido rimodellamento osseo18, è anche un modo per risparmiare tempo per studiare gli effetti della forza meccanica sul rimodellamento osseo rispetto ad altri modelli con un lungo periodo sperimentale. Pertanto, l’OTM è un modello ideale per studiare il rimodellamento osseo sotto stimoli meccanici. È interessante notare che il meccanismo del rimodellamento dell’osso alveolare è spesso sensibile al tempo ed è necessario osservare i cambiamenti nel rimodellamento dell’osso alveolare in determinati momenti dopo la modellazione. Con il duplice vantaggio del controllo temporale e spaziale della ricombinazione del DNA e della specificità tissutale, un modello murino knockout genico condizionale inducibile è una scelta adatta per gli studi OTM.
Convenzionalmente, il rimodellamento dell’osso alveolare mediato da OTM è stato suddiviso in zone di tensione che coinvolgono la formazione ossea e zone di pressione che coinvolgono il riassorbimento osseo 19,20,21, che è più dettagliato ma difficile da regolare. Inoltre, Yuri et al. hanno riportato che il tempo di formazione dell’osso in OTM differiva sui lati di tensione e compressione22. Inoltre, uno studio precedente aveva dimostrato che il primo molare poteva avviare un ampio rimodellamento dell’osso alveolare mascellare sotto la forza ortodontica, che non era vincolata alle zone di tensione e pressione23. Pertanto, abbiamo selezionato l’area situata all’interno di tre radici di M1 nella sezione trasversale dell’osso mascellare come regione di interesse (ROI) e abbiamo descritto metodi per valutare l’attività di osteoblasti e osteoclasti nella stessa area per valutare il rimodellamento dell’osso alveolare sotto OTM.
Come fattore di trascrizione nucleare, il trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3) si è dimostrato critico nell’omeostasi ossea24,25. Studi precedenti hanno riportato bassa densità minerale ossea e fratture patologiche ricorrenti nei topi con mutazione Stat3 26,27. Il nostro studio precedente ha dimostrato che la delezione di Stat3 negli osteoblasti Osx+ ha causato malformazione craniofacciale e osteoporosi, nonché fratture ossee spontanee28. Recentemente, abbiamo fornito evidenze in vivo con un modello murino inducibile di delezione di Stat3 osteoblasto-specifico (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, di seguito denominato Stat3Col1α2ERT2) che STAT3 è fondamentale nel mediare gli effetti della forza ortodontica che guida il rimodellamento dell’osso alveolare29. In questo studio, forniamo metodi e protocolli per l’utilizzo di topi knockout Stat3 inducibili per la linea osteoblastica specifica per studiare il rimodellamento osseo sotto forza ortodontica e descrivere metodi per analizzare il rimodellamento osseo alveolare durante l’OTM, facendo così luce sulla biologia meccanica scheletrica.
Poiché la malocclusione è tra i disturbi orali più comuni che compromettono la respirazione, la masticazione, il parlare e persino l’aspetto, la domanda di ortodonzia aumenta di giorno in giorno con l’incidenza che sale dal 70% al 93% secondo una precedente indagine epidemiologica31,32. Come accelerare il rimodellamento dell’osso alveolare per aumentare l’efficienza del trattamento ortodontico in modo sicuro è diventato un argomento caldo in questo campo; per…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); la Fondazione di Scienze Naturali di Shanghai (21ZR1436900, 22ZR1436700); il programma di Shanghai Academic/Technology Research Leader (20XD1422300); Piano di Ricerca Clinica di SHDC (SHDC2020CR4084); il Fondo di ricerca interdisciplinare del Nono Ospedale del Popolo di Shanghai, Scuola di Medicina dell’Università Jiao Tong di Shanghai (JYJC201902, JYJC202116); il team di ricerca sull’innovazione delle università locali di alto livello di Shanghai (SSMUZLCX20180501); il Fondo per la Disciplina della Ricerca n. KQYJXK2020 del Ninth People’s Hospital, della Shanghai Jiao Tong University School of Medicine e del College of Stomatology della Shanghai Jiao Tong University; Progetto di esplorazione originale del Nono Ospedale del Popolo di Shanghai, Scuola di Medicina dell’Università Jiao Tong di Shanghai (JYYC003); Progetto Duecento Talenti della Scuola di Medicina dell’Università Jiao Tong di Shanghai; il progetto di ricerca cooperativa dell’Istituto di biomateriali e medicina rigenerativa Scuola di medicina dell’Università Jiao Tong di Shanghai (2022LHB02); il Progetto della Biobanca del Nono Ospedale del Popolo di Shanghai, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).
1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
Zoletil | VIRBAC |