Denne undersøgelse giver en protokol til brug af inducerbare osteoblastafstamningsspecifikke Stat3 knockout-mus til at studere knoglemodellering under ortodontisk kraft og beskriver metoder til analyse af alveolær knoglemodellering under ortodontisk tandbevægelse og kaster således lys over skeletmekanisk biologi.
Den alveolære knogle, med en høj omsætningshastighed, er den mest aktivt ombyggende knogle i kroppen. Ortodontisk tandbevægelse (OTM) er en almindelig kunstig proces med alveolær knoglemodellering som reaktion på mekanisk kraft, men den underliggende mekanisme forbliver undvigende. Tidligere undersøgelser har ikke været i stand til at afsløre den præcise mekanisme for knoglemodellering på noget tidspunkt og rum på grund af dyremodelrelaterede begrænsninger. Signaltransduceren og aktivatoren af transkription 3 (STAT3) er vigtig i knoglemetabolisme, men dens rolle i osteoblaster under OTM er uklar. For at tilvejebringe in vivo-bevis for, at STAT3 deltager i OTM på bestemte tidspunkter og i bestemte celler under OTM, genererede vi en tamoxifen-inducerbar osteoblastafstamningsspecifik Stat3 knockout-musemodel, anvendte ortodontisk kraft og analyserede den alveolære knoglefænotype.
Mikrocomputertomografi (Micro-CT) og stereomikroskopi blev brugt til at få adgang til OTM-afstand. Histologisk analyse valgte området inden for tre rødder af den første molære (M1) i tværsnittet af den maksillære knogle som interesseområde (ROI) for at evaluere den metaboliske aktivitet af osteoblaster og osteoklaster, hvilket indikerer effekten af ortodontisk kraft på alveolær knogle. Kort sagt leverer vi en protokol til brug af inducerbare osteoblastafstamningsspecifikke Stat3 knockout-mus til at studere knoglemodellering under ortodontisk kraft og beskrive metoder til analyse af alveolær knoglemodellering under OTM og dermed kaste nyt lys over skeletmekanisk biologi.
Det er almindeligt kendt, at knogle er under konstant genopbygning gennem hele livet som reaktion på mekaniske kræfter i henhold til Wolffs lov 1,2. Passende mekanisk stimulering, såsom tyngdekraft og daglig motion, opretholder knoglemasse og styrke og forhindrer knogletab ved at stimulere både osteoblaster og osteoklaster. Osteoklaster, der er ansvarlige for knogleresorption 3,4,5,6,7, og osteoblaster, der er ansvarlige for knogledannelse 8,9,10, opretholder knoglehomeostase og fungerer sammen i den biologiske proces med knoglemodellering. I modsætning hertil lider knogler i mangel af belastningsstimuli, som hos astronauter under langvarig mikrogravity, 10% knoglemineraltæthedstab, hvilket øger risikoen for osteoporose11,12. Desuden er ikke-invasive og bekvemme mekaniske terapier, herunder tandregulering og distraktionsosteogenese, opstået som behandlinger for knoglesygdomme13,14. Alle disse har vist, at mekanisk kraft spiller en afgørende rolle for at opretholde knoglekvalitet og kvantitet. Nylige undersøgelser analyserede generelt knoglemodellering som reaktion på mekanisk belastning ved hjælp af tidskrævende modeller såsom løbehjuls- og haleophængstest, som normalt tog 4 uger eller mere at simulere kraftbelastning eller losning15,16. Derfor er der efterspørgsel efter en bekvem og effektiv dyremodel til at studere knogleremodellering drevet af kraftbelastning.
Den alveolære knogle er den mest aktive med hensyn til knoglemodellering med en høj omsætningshastighed17. Ortodontisk tandbevægelse (OTM), en almindelig behandling for malokklusion, er en kunstig proces med alveolær knoglemodellering som reaktion på mekanisk kraft. OTM, som inducerer hurtig knoglemodellering18, er imidlertid også en tidsbesparende måde at studere virkningerne af mekanisk kraft på knoglemodellering sammenlignet med andre modeller med en lang eksperimentel periode. Derfor er OTM en ideel model til at studere knoglemodellering under mekaniske stimuli. Det er bemærkelsesværdigt, at mekanismen for alveolær knoglemodellering ofte er tidsfølsom, og det er nødvendigt at observere ændringerne i alveolær knoglemodellering på bestemte tidspunkter efter modellering. Med de dobbelte fordele ved tidsmæssig og rumlig kontrol af DNA-rekombination og vævsspecificitet er en inducerbar betinget gen-knockout-musemodel et passende valg til OTM-undersøgelser.
Konventionelt er OTM-medieret alveolær knoglemodellering blevet opdelt i spændingszoner, der involverer knogledannelse og trykzoner, der involverer knogleresorption 19,20,21, hvilket er mere detaljeret, men vanskeligt at regulere. Desuden rapporterede Yuri et al., at tidspunktet for knogledannelse i OTM varierede på spændings- og kompressionssiderne22. Derudover havde en tidligere undersøgelse vist, at den første molære kunne indlede bred ombygning af den maksillære alveolære knogle under ortodontisk kraft, som ikke var begrænset til spændings- og trykzonerne23. Derfor valgte vi området inden for tre rødder af M1 i tværsnittet af den maksillære knogle som interesseområde (ROI) og beskrev metoder til at vurdere aktiviteten af osteoblaster og osteoklaster i samme område for at evaluere alveolær knoglemodellering under OTM.
Som en nuklear transkriptionsfaktor har signaltransducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) vist sig kritisk i knoglehomeostase24,25. Tidligere undersøgelser har rapporteret lav knoglemineraltæthed og tilbagevendende patologiske frakturer hos Stat3-mutante mus26,27. Vores tidligere undersøgelse viste, at sletning af Stat3 i Osx + osteoblaster forårsagede kraniofacial misdannelse og osteoporose samt spontan knoglebrud28. For nylig leverede vi in vivo-bevis med en inducerbar osteoblastspecifik Stat3-deletionsmusemodel (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, i det følgende kaldet Stat3Col1α2ERT2), at STAT3 er afgørende for formidling af virkningerne af ortodontisk kraft, der driver alveolær knoglemodellering29. I denne undersøgelse leverer vi metoder og protokoller til brug af inducerbare osteoblastafstamningsspecifikke Stat3 knockout-mus til at studere knoglemodellering under ortodontisk kraft og beskrive metoder til analyse af alveolær knoglemodellering under OTM og dermed kaste lys over skeletmekanisk biologi.
Da malokklusion er blandt de mest almindelige orale lidelser, der forringer vejrtrækning, mastication, tale og endda udseende, stiger efterspørgslen efter tandregulering dag for dag, hvor forekomsten stiger fra 70% til 93% ifølge en tidligere epidemiologisk undersøgelse31,32. Hvordan man fremskynder alveolær knoglemodellering for at øge effektiviteten af tandregulering sikkert er blevet et varmt emne på dette område; derfor er det nødvendigt at præciser…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); Natural Science Foundation of Shanghai (21ZR1436900, 22ZR1436700); Programmet for Shanghai Academic / Technology Research Leader (20XD1422300); Klinisk forskningsplan for SHDC (SHDC2020CR4084); den tværfaglige forskningsfond for Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYJC201902, JYJC202116) innovationsforskningsteamet ved lokale universiteter på højt niveau i Shanghai (SSMUZLCX20180501) Forskningsdisciplinfonden nr. KQYJXK2020 fra Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine og College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University; Oprindeligt efterforskningsprojekt for Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYYC003); Tohundrede talentprojekt fra Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Biomaterials and Regenerative Medicine Institute Cooperative Research Project Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); Projektet fra Biobank of Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).
1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
Zoletil | VIRBAC |