Considérations pratiques pour la conception, l’exécution et l’interprétation d’études portant sur des essais de flexion d’os de rongeurs sur des os entiers
Summary
L’analyse mécanique des os de rongeurs est une méthode précieuse pour extraire des informations sur la susceptibilité d’un os à se fracturer. En l’absence d’une bonne compréhension pratique, les résultats peuvent être surinterprétés ou manquer de validité. Ce protocole servira de guide pour s’assurer que les essais mécaniques sont effectués avec précision afin de fournir des données valides et fonctionnelles.
Abstract
La fragilité squelettique conduisant à la fracture est une crise de santé publique américaine qui entraîne 1,5 million de fractures chaque année et 18 milliards de dollars en coûts directs de soins. La capacité de comprendre les mécanismes sous-jacents à la maladie osseuse et la réponse au traitement est non seulement souhaitée, mais essentielle. L’analyse mécanique de l’os est une technique précieuse pour comprendre et quantifier la susceptibilité d’un os à la fracture. Bien que cette méthode semble simple à mettre en œuvre, des conclusions inappropriées et inexactes peuvent être tirées si les hypothèses et les étapes clés ne sont pas prises en compte par l’utilisateur. Cela a été observé dans toutes les disciplines, car les études continuent d’être publiées avec une mauvaise utilisation des méthodes et une interprétation incorrecte des résultats. Ce protocole servira d’introduction aux principes associés aux essais mécaniques ainsi qu’à l’application de ces techniques, depuis les considérations relatives à la taille de l’échantillon jusqu’à l’analyse et l’interprétation des données, en passant par le prélèvement et l’entreposage des tissus. Avec cela à l’appui, il est possible d’obtenir des informations précieuses sur la susceptibilité d’un os à la fracture, ce qui permet de mieux comprendre les résultats de la recherche universitaire et des solutions cliniques.
Introduction
L’analyse mécanique de l’os est la principale méthode pour extraire des informations fonctionnelles liées à la susceptibilité d’un os à la fracture. Dans les études précliniques, plusieurs modalités de test peuvent être utilisées, mais la plus courante est de loin la flexion des os longs. Ces tests sont faciles à réaliser et peuvent être utilisés sur des os dont la taille varie de l’homme à la souris. La souris étant l’un des animaux les plus étudiés dans la recherche préclinique, ce protocole se concentrera sur les tests de flexion effectués sur les fémurs et les tibias des souris.
Avant d’effectuer des tests de flexion, les os doivent être correctement récoltés et stockés. Les méthodes de stockage les plus courantes ont traditionnellement été la congélation des os dans de la gaze imbibée de solution saline, la congélation dans une solution saline seule ou la déshydratation des os dans de l’éthanol 1. Il a été démontré que les os stockés dans l’éthanol ont une rigidité et un module d’élasticité accrus et des paramètres de déformation diminués par rapport à ceux stockés congelés1. Même la réhydratation des os avant le test ne permet pas de retrouver ces propriétés à des niveaux normaux 1. L’entreposage immergé dans une solution saline pourrait endommager l’os, car la pression est exercée lorsque la solution saline se dilate. De plus, une décongélation complète de la solution serait nécessaire pour prélever les os en vue d’une microtomodensitométrie (μCT). Par conséquent, la congélation des os fraîchement récoltés dans de la gaze imbibée de solution saline est devenue la méthode de stockage standard et est recommandée tout au long de ce protocole.
Étant donné que la taille et la forme d’un os affectent sa force apparente et que de nombreux modèles de maladies modifient considérablement la taille et la morphologie des os, les principes d’ingénierie sont utilisés pour normaliser les effets de la taille afin de produire des propriétés qui estiment le comportement du tissu2. Cette approche nécessite une géométrie en coupe transversale de l’emplacement de la défaillance, qui est le plus souvent acquise à l’aide de μCT pour créer des scans des os avant les tests. Le μCT est largement utilisé en raison de sa disponibilité et de sa haute résolution d’image. De plus, les apports de tissus mous ne sont pas inclus, et la scintigraphie ne nécessite pas de fixation chimique ou d’autres modifications de l’os 3,4. Dans toutes les formes de tomodensitométrie, une source de rayons X est focalisée sur un objet tandis qu’un détecteur situé de l’autre côté de l’objet mesure l’énergie des rayons X qui en résulte. Cela produit une ombre radiographique de l’échantillon qui peut être convertie en une image 3,5. L’objet scanné est tourné (ou la source de rayons X et le détecteur sont tournés autour de l’échantillon), générant des images qui peuvent être reconstruites en un ensemble de données tridimensionnelles représentant l’objet5.
La résolution de numérisation, c’est-à-dire la proximité entre deux objets et pouvant être résolus individuellement, est contrôlée en modifiant la taille nominale du voxel ou la taille d’un pixel dans l’image résultante. Il est généralement admis que les objets doivent être au moins deux fois plus grands qu’un seul voxel pour être identifiés3, mais un rapport plus élevé permettra d’améliorer la précision. De plus, les voxels plus grands sont plus sujets aux effets de volume partiel : lorsqu’un seul voxel contient des tissus de densités variables, on lui attribue la moyenne de ces densités, plutôt que la densité spécifique d’un seul tissu, ce qui peut conduire à une surestimation ou à une sous-estimation des surfaces tissulaires et de la densité minérale3. Bien que ces problèmes puissent être atténués en choisissant des tailles de voxel plus petites, l’utilisation d’une résolution plus élevée ne garantit pas l’élimination des effets de volume partiels et peut nécessiter des temps de balayage plus longs3. Lors de la scintigraphie des os ex vivo, une taille de voxel de 6 à 10 μm est généralement recommandée pour évaluer avec précision l’architecture trabéculaire des os de souris. Une taille de voxel plus grande de 10 à 17 μm peut être utilisée pour l’os cortical, bien que la plus petite taille de voxel raisonnable doive être utilisée. Ce protocole utilise une taille de voxel de 10 μm, ce qui est suffisamment petit pour différencier les principales propriétés trabéculaires et minimiser les effets de volume partiels sans temps de balayage prolongé.
Les réglages de l’énergie des rayons X et du filtre d’énergie doivent également être sélectionnés avec soin, car la densité minérale et l’épaisseur élevées du tissu osseux atténuent et modifient considérablement le spectre d’énergie des rayons X transmis. Il est généralement admis que, parce que le spectre des rayons X émis est équivalent au spectre qui sort de l’objet6, l’utilisation de rayons X de faible énergie sur des objets denses tels que les os peut conduire à un artefact connu sous le nom de durcissement du faisceau7. Une tension plus élevée de 50 à 70 kVc est recommandée lors de l’analyse des échantillons d’os afin de réduire l’incidence de ces artefacts5. De plus, l’insertion d’un filtre d’énergie en aluminium ou en cuivre crée un faisceau d’énergie plus concentré, minimisant davantage les artefacts 4,7. Un filtre en aluminium de 0,5 mm sera utilisé tout au long de ce protocole.
Enfin, l’étape de rotation de la numérisation et la longueur de rotation (par exemple, 180°-360°) contrôlent ensemble le nombre d’images capturées, ce qui détermine la quantité de bruit dans la numérisation finale4. La moyenne de plusieurs images à chaque étape peut réduire le bruit, mais peut augmenter le temps de numérisation4. Ce protocole utilise un pas de rotation de 0,7 degré et une moyenne de 2 degrés.
Une dernière remarque à propos de la numérisation : les fantômes d’étalonnage de l’hydroxyapatite doivent être scannés en utilisant les mêmes paramètres de balayage que les os expérimentaux pour permettre la conversion des coefficients d’atténuation en densité minérale en g/cm35. Ce protocole utilise des fantômes de 0,25 g/cm 3 et 0,75 g/cm3 d’hydroxyapatite, bien que différents fantômes soient disponibles. Notez que certains systèmes de balayage utilisent des fantômes internes dans le cadre de l’étalonnage quotidien du système.
Une fois le balayage terminé, les projections angulaires sont reconstruites en images en coupe transversale de l’objet, généralement à l’aide du logiciel d’accompagnement du fabricant. Quel que soit le système utilisé, il est important de s’assurer que l’os entier est capturé dans la reconstruction et que le seuil est défini de manière appropriée pour permettre la reconnaissance de l’os par rapport au non-os. Après la reconstruction, il est essentiel de faire pivoter tous les scans en trois dimensions afin que les os soient orientés de manière cohérente et correctement alignés avec l’axe transversal, toujours à l’aide du logiciel du fabricant.
Après la rotation, les régions d’intérêt (ROI) pour l’analyse peuvent être sélectionnées selon que les propriétés corticales, les propriétés trabéculaires ou la géométrie de la fracture pour la normalisation mécanique sont souhaitées. Dans ce dernier cas, les ROI doivent être sélectionnés après le test en mesurant la distance entre le site de fracture et une extrémité de l’os et en utilisant la taille du voxel pour déterminer l’emplacement de la tranche correspondante dans le fichier de numérisation. La région sélectionnée doit avoir une longueur d’au moins 100 μm, avec le point de fracture au centre approximatif du ROI, pour fournir une estimation adéquate4.
Lorsque les retours sur investissement sont sélectionnés, deux propriétés sont nécessaires pour la normalisation mécanique (pour calculer la contrainte de flexion et la déformation) : la distance maximale entre l’axe de flexion neutre et la surface où la rupture est initiée (supposée être la surface chargée en tension, déterminée par la configuration d’essai) et le moment d’inertie de la zone autour de l’axe neutre (également en fonction de la configuration d’essai). Ce protocole recommande l’utilisation d’un code personnalisé pour déterminer ces valeurs. Pour accéder au code, contactez directement l’auteur correspondant ou visitez le site Web du laboratoire à l’adresse https://bbml.et.iupui.edu/ pour plus d’informations.
Une fois la tomodensitométrie terminée, les essais mécaniques peuvent commencer. Les essais de flexion peuvent être effectués dans des configurations à quatre ou trois points. Les essais de flexion en quatre points sont préférés car ils éliminent la contrainte de cisaillement dans l’os entre les points de charge, ce qui permet une flexion pure dans cette région3. L’os va alors se fracturer sous l’effet de la tension, créant une défaillance plus représentative des véritables propriétés de flexion de l’os3. Cependant, l’os doit être chargé de manière à fournir la même charge aux deux points de chargement (cela peut être facilité par une tête de chargement pivotante). Dans les essais de flexion en trois points, il y a un grand changement de contrainte de cisaillement à l’endroit où le point de charge rencontre l’os, ce qui provoque la rupture de l’os à ce stade en raison du cisaillement et non de la tension3. Les normes ASTM recommandent que les matériaux soumis à la flexion aient un rapport longueur/largeur de 16 :1, ce qui signifie que la longueur de la portée du support doit être 16 fois plus grande que la largeur de l’os pour minimiser les impacts du cisaillement 8,9. Ceci est souvent impossible à réaliser lors de l’essai de petits os de rongeurs, de sorte que la portée de chargement est simplement rendue aussi grande que possible, mais avec un changement de forme de section aussi faible que possible. De plus, lors de la flexion à quatre points, le rapport entre les longueurs de l’envergure inférieure et supérieure doit être de ~3 :18, ce qui peut généralement être réalisé dans le tibia, mais c’est difficile dans le fémur plus court. De plus, les parois corticales plus minces des fémurs les rendent sensibles à la déformation de type anneau qui modifie la forme de la section transversale osseuse pendant le test (cela peut être accentué dans les tests à quatre points car une force plus importante est nécessaire pour induire le même moment de flexion par rapport à la flexion à trois points). Par conséquent, la flexion en trois points sera utilisée pour les fémurs de souris, tandis que la flexion en quatre points sera utilisée pour les tibias tout au long de ce protocole.
Enfin, il est important d’alimenter correctement l’étude pour l’analyse statistique. Une recommandation générale pour les essais mécaniques est d’avoir une taille d’échantillon de 10 à 12 os par groupe expérimental pour être en mesure de détecter les différences, car certaines propriétés mécaniques, en particulier les paramètres post-rendement, peuvent être très variables. Dans certains cas, cela peut signifier commencer avec un échantillon d’animaux de plus grande taille compte tenu de l’attrition qui pourrait se produire au cours de l’étude. L’analyse de la taille de l’échantillon à l’aide des données existantes doit être effectuée avant de tenter une étude.
Il existe de nombreuses limites et hypothèses, mais les tests de flexion peuvent fournir des résultats assez précis, en particulier lorsque les différences relatives entre les groupes sont intéressantes. Ces propriétés, ainsi que l’analyse de l’architecture trabéculaire et de la morphologie corticale, peuvent fournir un meilleur aperçu des états pathologiques et des schémas thérapeutiques. Si l’on prend soin des aspects de l’expérience qui sont sous notre contrôle (par exemple, la récolte, le stockage, la numérisation et les tests), nous pouvons être sûrs que des résultats précis ont été générés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tout au long du processus d’analyse et de test, il y a des moments où le dépannage et l’optimisation sont appropriés. Le premier d’entre eux se produit lors de la numérisation des os à l’aide de μCT. Alors que de nombreux systèmes sont livrés avec un support dans lequel un objet peut être tenu et scanné, des supports personnalisés peuvent être fabriqués pour numériser plusieurs os en même temps. L’analyse de plusieurs os peut être un excellent point d’optimisation, mais des précautions doiven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail effectué pour développer ce protocole a été soutenu par les National Institutes of Health [AR072609].
Materials
| CTAn | Bruker | NA | CT Scan Analysis Software |
| DataViewer | Bruker | NA | CT Scan Rotation Software |
| Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a | MathWorks | NA | Coding platform used for data analysis |
| NRecon | Bruker | NA | CT Scan Reconstruction software |
| SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software | Micro Photonics Inc | SKY-016814 | Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object |
References
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