Praktische Überlegungen für das Design, die Durchführung und die Interpretation von Studien mit Ganzknochenbiegetests an Nagetierknochen
Summary
Die mechanische Prüfung von Nagetierknochen ist eine wertvolle Methode, um Informationen über die Bruchanfälligkeit eines Knochens zu gewinnen. Mangels angemessenem praktischem Verständnis können die Ergebnisse überinterpretiert werden oder keine Gültigkeit haben. Dieses Protokoll dient als Leitfaden, um sicherzustellen, dass mechanische Tests genau durchgeführt werden, um gültige und funktionsfähige Daten zu liefern.
Abstract
Die Zerbrechlichkeit des Skeletts, die zu Frakturen führt, ist eine Krise der öffentlichen Gesundheit in den USA, die jedes Jahr zu 1,5 Millionen Frakturen und 18 Milliarden US-Dollar an direkten Pflegekosten führt. Die Fähigkeit, die Mechanismen, die Knochenerkrankungen zugrunde liegen, und das Ansprechen auf die Behandlung zu verstehen, ist nicht nur erwünscht, sondern entscheidend. Die mechanische Prüfung von Knochen ist eine wertvolle Technik, um die Bruchanfälligkeit eines Knochens zu verstehen und zu quantifizieren. Obwohl diese Methode einfach durchzuführen erscheint, können unangemessene und ungenaue Schlussfolgerungen gezogen werden, wenn maßgebliche Annahmen und wichtige Schritte vom Benutzer missachtet werden. Dies ist disziplinübergreifend zu beobachten, da weiterhin Studien mit Missbrauch von Methoden und falscher Interpretation der Ergebnisse veröffentlicht werden. Dieses Protokoll dient als Grundlage für die Prinzipien, die mit mechanischen Tests verbunden sind, sowie für die Anwendung dieser Techniken – von Überlegungen zur Probengröße über die Gewebeentnahme und -lagerung bis hin zur Datenanalyse und -interpretation. Auf diese Weise können wertvolle Informationen über die Frakturanfälligkeit eines Knochens gewonnen werden, die das Verständnis sowohl für die akademische Forschung als auch für klinische Lösungen fördern.
Introduction
Die mechanische Prüfung von Knochen ist die primäre Methode, um funktionelle Informationen über die Bruchanfälligkeit eines Knochens zu extrahieren. In präklinischen Studien können mehrere Testmodalitäten verwendet werden, aber die bei weitem häufigste ist das Biegen von Röhrenknochen. Diese Tests sind einfach durchzuführen und können an Knochen unterschiedlicher Größe von Mensch bis Maus angewendet werden. Da Mäuse zu den am häufigsten untersuchten Tieren in der präklinischen Forschung gehören, konzentriert sich dieses Protokoll auf Biegetests, die an den Oberschenkelknochen und Tibiae von Mäusen durchgeführt werden.
Vor der Durchführung von Biegeversuchen müssen die Knochen ordnungsgemäß entnommen und gelagert werden. Die gebräuchlichsten Lagerungsmethoden waren traditionell das Einfrieren von Knochen in salzgetränkter Gaze, das Einfrieren in Kochsalzlösung allein oder das Dehydrieren von Knochen in Ethanol 1. Es hat sich gezeigt, dass in Ethanol gelagerte Knochen eine höhere Steifigkeit und einen höheren Elastizitätsmodul sowie geringere Verformungsparameter aufweisen als Knochen, die gefroren gelagert werden1. Selbst wenn die Knochen vor dem Test rehydriert werden, werden diese Eigenschaften nicht wieder auf ein normales Niveau zurückgeführt 1. Die Lagerung in Kochsalzlösung kann den Knochen schädigen, da Druck ausgeübt wird, wenn sich die Kochsalzlösung ausdehnt. Darüber hinaus wäre ein vollständiges Auftauen der Lösung erforderlich, um die Knochen für die Mikrocomputertomographie (μCT) zu entfernen. Folglich ist das Einfrieren frisch geernteter Knochen in salzgetränkter Gaze zur Standard-Lagerungsmethode geworden und wird in diesem Protokoll empfohlen.
Da die Größe und Form eines Knochens seine Volumenfestigkeit beeinflussen und viele Krankheitsmodelle die Knochengröße und -morphologie erheblich verändern, werden technische Prinzipien verwendet, um die Auswirkungen der Größe zu normalisieren und Eigenschaften zu erzeugen, die das Verhalten des Gewebes abschätzen2. Dieser Ansatz erfordert eine Querschnittsgeometrie der Versagensstelle, die am häufigsten mit μCT erfasst wird, um Scans der Knochen vor dem Test zu erstellen. μCT ist aufgrund seiner Verfügbarkeit und hohen Bildauflösung weit verbreitet. Darüber hinaus sind Beiträge von Weichgewebe nicht enthalten, und das Scannen erfordert keine chemische Fixierung oder andere Modifikationen des Knochens 3,4. Bei allen Formen der CT wird eine Röntgenquelle auf ein Objekt fokussiert, während ein Detektor auf der anderen Seite des Objekts die resultierende Röntgenenergie misst. Dadurch entsteht ein Röntgenschatten der Probe, der in ein Bildumgewandelt werden kann 3,5. Das zu scannende Objekt wird gedreht (oder die Röntgenquelle und der Detektor werden um die Probe gedreht), wodurch Bilder erzeugt werden, die in einen dreidimensionalen Datensatz rekonstruiert werden können, der das Objekt5 darstellt.
Die Scanauflösung, d. h. wie nahe zwei Objekte einzeln beieinander liegen und dennoch aufgelöst werden können, wird durch Ändern der nominalen Voxelgröße oder der Größe eines Pixels im resultierenden Bild gesteuert. Es ist allgemein anerkannt, dass Objekte mindestens doppelt so groß sein müssen wie ein einzelnes Voxel3, aber ein höheres Verhältnis ermöglicht eine verbesserte Präzision. Darüber hinaus sind größere Voxel anfälliger für Teilvolumeneffekte: Wenn ein einzelnes Voxel Gewebe unterschiedlicher Dichte enthält, wird ihm der Durchschnitt dieser Dichten und nicht die spezifische Dichte eines einzelnen Gewebes zugewiesen, was zu einer Über- oder Unterschätzung der Gewebebereiche und der Mineraldichte führen kann3. Diese Probleme können zwar durch die Wahl kleinerer Voxelgrößen gemildert werden, aber die Verwendung einer höheren Auflösung gewährleistet nicht die Eliminierung von Teilvolumeneffekten und erfordert möglicherweise längere Scanzeiten3. Beim Ex-vivo-Scan von Knochen wird im Allgemeinen eine Voxelgröße von 6-10 μm empfohlen, um die trabekuläre Architektur von Mausknochen genau beurteilen zu können. Für kortikalen Knochen kann eine größere Voxelgröße von 10-17 μm verwendet werden, obwohl die kleinste sinnvolle Voxelgröße verwendet werden sollte. Dieses Protokoll verwendet eine Voxelgröße von 10 μm, die klein genug ist, um wichtige trabekuläre Eigenschaften zu differenzieren und Teilvolumeneffekte ohne lange Scanzeit zu minimieren.
Auch die Einstellungen für Röntgenenergie und Energiefilter müssen sorgfältig gewählt werden, da die hohe Mineraldichte und Dicke des Knochengewebes das transmittierte Röntgenenergiespektrum stark abschwächt und verändert. Es wird allgemein angenommen, dass, da das emittierte Röntgenspektrum äquivalent zu dem Spektrum ist, das das Objekt6 verlässt, die Verwendung von niederenergetischer Röntgenstrahlung auf dichte Objekte wie Knochen zu einem Artefakt führen kann, das als Strahlhärtung7 bekannt ist. Beim Scannen von Knochenproben wird eine höhere Spannung von 50-70 kVp empfohlen, um das Auftreten dieser Artefakte zu reduzieren5. Darüber hinaus erzeugt das Einsetzen eines Aluminium- oder Kupfer-Energiefilters einen konzentrierteren Energiestrahl, wodurch Artefakte weiter minimiertwerden 4,7. Während dieses Protokolls wird ein 0,5-mm-Aluminiumfilter verwendet.
Schließlich steuern der Scan-Rotationsschritt und die Rotationslänge (z. B. 180°-360°) zusammen die Anzahl der aufgenommenen Bilder, die die Menge des Rauschens im endgültigen Scan4 bestimmt. Die Mittelung mehrerer Frames in jedem Schritt kann das Rauschen reduzieren, aber die Scanzeit verlängern4. Dieses Protokoll verwendet einen Rotationsschritt von 0,7 Grad und eine Frame-Mittelung von 2.
Eine letzte Anmerkung zum Scannen: Hydroxylapatit-Kalibrierphantome sollten mit den gleichen Scaneinstellungen wie die experimentellen Knochen gescannt werden, um die Umrechnung der Dämpfungskoeffizienten in die Mineraldichte in g/cm35 zu ermöglichen. Dieses Protokoll verwendet Phantome von 0,25 g/cm3 und 0,75 g/cm3 Hydroxylapatit, obwohl verschiedene Phantome verfügbar sind. Beachten Sie, dass einige Scansysteme interne Phantome als Teil der täglichen Systemkalibrierung verwenden.
Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, werden die Winkelprojektionen zu Querschnittsbildern des Objekts rekonstruiert, in der Regel mit der begleitenden Software des Herstellers. Unabhängig davon, welches System verwendet wird, ist es wichtig sicherzustellen, dass der gesamte Knochen bei der Rekonstruktion erfasst wird und dass die Schwellenwerte angemessen festgelegt werden, um die Erkennung von Knochen und Nicht-Knochen zu ermöglichen. Nach der Rekonstruktion ist es wichtig, alle Scans dreidimensional zu drehen, damit die Knochen konsistent ausgerichtet und richtig mit der Querachse ausgerichtet sind, wiederum mit der Software des Herstellers.
Nach der Rotation können Regions of Interest (ROI) für die Analyse ausgewählt werden, je nachdem, ob kortikale Eigenschaften, trabekuläre Eigenschaften oder Bruchgeometrie für die mechanische Normalisierung gewünscht werden. Bei letzterem sollten ROIs nach dem Test ausgewählt werden, indem der Abstand von der Frakturstelle zu einem Ende des Knochens gemessen und die Voxelgröße verwendet wird, um die entsprechende Schichtposition in der Scandatei zu bestimmen. Die ausgewählte Region sollte mindestens 100 μm lang sein, wobei der Bruchpunkt ungefähr in der Mitte des ROI liegen sollte, um eine angemessene Schätzung zu ermöglichen4.
Wenn ROIs ausgewählt sind, werden zwei Eigenschaften für die mechanische Normalisierung (zur Berechnung der Biegespannung und -dehnung) benötigt: der maximale Abstand von der neutralen Biegeachse zur Oberfläche, an der das Versagen ausgelöst wird (angenommen wird die unter Spannung belastete Fläche, die durch den Versuchsaufbau bestimmt wird) und das Flächenträgheitsmoment um die neutrale Achse (ebenfalls abhängig vom Versuchsanordnung). Dieses Protokoll empfiehlt die Verwendung eines benutzerdefinierten Codes, um diese Werte zu bestimmen. Für den Zugriff auf den Code wenden Sie sich direkt an den korrespondierenden Autor oder besuchen Sie die Lab-Website unter https://bbml.et.iupui.edu/ für weitere Informationen.
Sobald der μCT-Scan abgeschlossen ist, kann mit der mechanischen Prüfung begonnen werden. Biegeversuche können entweder in Vierpunkt- oder Dreipunktkonfiguration durchgeführt werden. Vier-Punkt-Biegeversuche werden bevorzugt, da sie die Scherspannung im Knochen zwischen den Belastungspunkten eliminieren und eine reine Biegung in diesem Bereich ermöglichen3. Der Knochen bricht dann aufgrund der Spannung, wodurch ein Versagen entsteht, das repräsentativer für die wahren Biegeeigenschaften des Knochensist 3. Der Knochen muss jedoch so belastet werden, dass er an beiden Belastungspunkten die gleiche Last abgibt (dies kann mit einem schwenkbaren Ladekopf erleichtert werden). Bei Dreipunktbiegeversuchen gibt es eine große Änderung der Scherspannung an der Stelle, an der der Belastungspunkt auf den Knochen trifft, was dazu führt, dass der Knochen an dieser Stelle aufgrund von Scherung bricht, nicht aufgrund von Spannung3. Die ASTM-Normen empfehlen, dass Materialien, die gebogen werden, ein Verhältnis von Länge zu Breite von 16:1 haben sollten, was bedeutet, dass die Länge der Stützspannweite 16-mal größer sein sollte als die Breite des Knochens, um die Auswirkungen der Scherungzu minimieren 8,9. Dies ist bei der Prüfung kleiner Nagetierknochen oft nicht zu erreichen, daher wird die Belastungsspanne einfach so groß wie möglich gemacht, aber mit einer möglichst geringen Veränderung der Querschnittsform. Darüber hinaus sollte bei der Durchführung der Vier-Punkt-Beugung das Verhältnis zwischen den Längen der unteren und oberen Spannweite ~3:18 betragen, was normalerweise im Schienbein erreicht werden kann, aber im kürzeren Oberschenkelknochen schwierig ist. Darüber hinaus machen die dünneren kortikalen Wände der Oberschenkelknochen sie anfällig für ringförmige Verformungen, die die Form des Knochenquerschnitts während des Tests verändern (dies kann bei Vierpunkttests akzentuiert werden, da im Vergleich zur Dreipunktbiegung eine größere Kraft erforderlich ist, um das gleiche Biegemoment zu induzieren). Daher wird die Drei-Punkt-Beugung für den Oberschenkelknochen der Maus verwendet, während die Vier-Punkt-Beugung für die Tibiae während des gesamten Protokolls verwendet wird.
Schließlich ist es wichtig, die Studie für die statistische Analyse richtig mit Strom zu versorgen. Eine allgemeine Empfehlung für mechanische Tests ist eine Stichprobengröße von 10-12 Knochen pro Versuchsgruppe, um Unterschiede erkennen zu können, da einige mechanische Eigenschaften, insbesondere Nachstreckungsparameter, sehr variabel sein können. In einigen Fällen kann dies bedeuten, dass mit einer höheren Stichprobengröße begonnen wird, da es während der Studie zu einer Abnutzung kommen könnte. Die Analyse der Stichprobengröße anhand vorhandener Daten sollte vor dem Versuch einer Studie abgeschlossen werden.
Es gibt zahlreiche Einschränkungen und Annahmen, aber Biegeversuche können recht genaue Ergebnisse liefern, insbesondere wenn relative Unterschiede zwischen Gruppen von Interesse sind. Diese Eigenschaften, zusammen mit der Analyse der trabekulären Architektur und der kortikalen Morphologie, können einen besseren Einblick in Krankheitszustände und Behandlungsschemata ermöglichen. Wenn die Aspekte des Experiments, die in unserer Kontrolle liegen (z. B. Ernte, Lagerung, Scannen und Testen), sorgfältig behandelt werden, können wir sicher sein, dass genaue Ergebnisse erzielt wurden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während des gesamten Scan- und Testprozesses gibt es Momente, in denen Fehlerbehebung und Optimierung angebracht sind. Die erste davon tritt auf, wenn Knochen mit μCT gescannt werden. Während viele Systeme mit einer Halterung geliefert werden, in der ein Objekt gehalten und gescannt werden kann, können benutzerdefinierte Halterungen hergestellt werden, um mehrere Knochen gleichzeitig zu scannen. Das Scannen mehrerer Knochen kann ein hervorragender Punkt für die Optimierung sein, aber während des gesamten Scan- und …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit zur Entwicklung dieses Protokolls wurde von den National Institutes of Health [AR072609 unterstützt.
Materials
| CTAn | Bruker | NA | CT Scan Analysis Software |
| DataViewer | Bruker | NA | CT Scan Rotation Software |
| Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a | MathWorks | NA | Coding platform used for data analysis |
| NRecon | Bruker | NA | CT Scan Reconstruction software |
| SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software | Micro Photonics Inc | SKY-016814 | Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object |
References
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