Praktiske hensyn for design, utførelse og tolkning av studier som involverer hele beinbøyetester av gnagerbein

Summary

Mekanisk testing av gnagerbein er en verdifull metode for å trekke ut informasjon om et beins følsomhet for brudd. Mangler riktig praktisk forståelse, kan resultatene bli overtolket eller mangle validitet. Denne protokollen vil fungere som en veiledning for å sikre at mekaniske tester utføres nøyaktig for å gi gyldige og funksjonelle data.

Abstract

Skjelettsårbarhet som fører til brudd er en amerikansk folkehelsekrise som resulterer i 1.5 millioner brudd hvert år og 18 milliarder dollar i direkte omsorgskostnader. Evnen til å forstå mekanismene som ligger til grunn for bein sykdom og respons på behandling er ikke bare ønsket, men kritisk. Mekanisk testing av bein tjener som en verdifull teknikk for å forstå og kvantifisere et beins følsomhet for brudd. Selv om denne metoden virker enkel å utføre, kan upassende og unøyaktige konklusjoner nås hvis styrende forutsetninger og viktige trinn blir ignorert av brukeren. Dette har blitt observert på tvers av disipliner ettersom studier fortsetter å bli publisert med misbruk av metoder og feil tolkning av resultater. Denne protokollen vil tjene som en primer for prinsippene knyttet til mekanisk testing sammen med anvendelsen av disse teknikkene – fra hensyn til prøvestørrelse gjennom vevshøsting og lagring, til dataanalyse og tolkning. Med dette i hånden kan verdifull informasjon om et beins følsomhet for brudd oppnås, noe som fremmer forståelse for både akademisk forskning og kliniske løsninger.

Introduction

Mekanisk testing av bein er den primære metoden for å trekke ut funksjonell informasjon relatert til et beins følsomhet for brudd. I prekliniske studier kan flere testmodaliteter brukes, men langt den vanligste er bøyning av lange bein. Disse testene er enkle å utføre og kan brukes på bein som varierer i størrelse fra menneske til mus. Siden mus er et av de mest studerte dyrene i preklinisk forskning, vil denne protokollen fokusere på bøyetester utført på femora og tibiae hos mus.

Før du utfører bøyetester, må bein høstes og lagres riktig. De vanligste lagringsmetodene har tradisjonelt vært frysing av bein i saltvannsdynket gasbind, frysing i saltvann alene eller dehydrering av bein i etanol ¹. Ben lagret i etanol har vist seg å ha økt stivhet og elastisk modul og reduserte deformasjonsparametere sammenlignet med de som er lagret frosset¹. Selv rehydrering av beinene før testing gjenoppretter ikke disse egenskapene tilbake til normale nivåer ¹. Lagring nedsenket i saltvann kan forårsake skade på beinet siden trykket utøves når saltvannet ekspanderer. I tillegg vil en fullstendig tining av løsningen være nødvendig for å fjerne beinene for mikrocomputertomografi (μCT) skanning. Følgelig har frysing av nyhøstede bein i saltvann-gjennomvåt gasbind blitt standard lagringsmetode og anbefales gjennom hele denne protokollen.

Fordi størrelsen og formen på et bein påvirker bulkstyrken og mange sykdomsmodeller endrer beinstørrelse og morfologi betydelig, brukes ingeniørprinsipper til å normalisere effekten av størrelse for å produsere egenskaper som estimerer vevets oppførsel². Denne tilnærmingen krever tverrsnittsgeometri av feilstedet, som oftest anskaffes ved hjelp av μCT for å lage skanninger av beinene før testing. μCT er mye brukt på grunn av tilgjengeligheten og den høye bildeoppløsningen. Videre er bidrag av bløtvev ikke inkludert, og skanning krever ikke kjemisk fiksering eller andre modifikasjoner på beinet ^3,4. I alle former for CT er en røntgenkilde fokusert på et objekt mens en detektor på den andre siden av objektet måler den resulterende røntgenenergien. Dette gir en røntgenskygge av prøven som kan konverteres til et bilde ^3,5. Objektet som skannes, roteres (eller røntgenkilden og detektoren roteres rundt prøven), og genererer bilder som kan rekonstrueres til et tredimensjonalt datasett som representerer objektet⁵.

Skanneoppløsning, eller hvor tett sammen to objekter kan være og fortsatt løses individuelt, styres ved å endre den nominelle voxelstørrelsen eller størrelsen på en piksel i det resulterende bildet. Det er generelt akseptert at objekter må være minst to ganger størrelsen på en enkelt voxel for å bli identifisert³, men et høyere forhold vil tillate forbedret presisjon. Videre er større voxels mer utsatt for partielle volumeffekter: når en enkelt voxel inneholder vev med varierende tettheter, tildeles den gjennomsnittet av disse tetthetene, i stedet for den spesifikke tettheten av et enkelt vev, noe som kan føre til over- eller underestimering av vevsområder og mineraltetthet³. Selv om disse problemene kan reduseres ved å velge mindre voxelstørrelser, sikrer ikke bruk av en høyere oppløsning eliminering av delvise volumeffekter og kan kreve lengre skannetider³. Ved skanning av bein ex vivo, anbefales en voxelstørrelse på 6-10 μm generelt for å nøyaktig vurdere den trabekulære arkitekturen til museben. En større voxelstørrelse på 10-17 μm kan brukes til kortikal bein, selv om den minste rimelige voxelstørrelsen bør brukes. Denne protokollen bruker en 10 μm voxelstørrelse, som er liten nok til å skille viktige trabekulære egenskaper og minimere delvise volumeffekter uten omfattende skannetid.

Røntgenenergi- og energifilterinnstillinger må også velges nøye, da den høye mineraltettheten og tykkelsen av beinvev i stor grad demper og endrer det overførte røntgenenergispekteret. Det antas generelt at fordi det utstrålede røntgenspekteret er ekvivalent med spekteret som går ut av objektet⁶, kan bruk av røntgenstråler med lav energi på tette gjenstander som bein føre til en artefakt kjent som stråleherding⁷. En høyere spenning på 50-70 kVp anbefales ved skanning av beinprøver for å redusere forekomsten av disse artefaktene⁵. I tillegg skaper innsetting av et energifilter av aluminium eller kobber en mer konsentrert energistråle, noe som ytterligere minimerer artefakter ^4,7. Et 0,5 mm aluminiumsfilter vil bli brukt i hele denne protokollen.

Til slutt kontrollerer skannerotasjonstrinnet og rotasjonslengden (f.eks. 180°-360°) sammen antall bilder som tas, noe som bestemmer mengden støy i den endelige skanningen⁴. Gjennomsnitt av flere bilder i hvert trinn kan redusere støy, men kan øke skannetiden⁴. Denne protokollen bruker et rotasjonstrinn på 0,7 grader og et rammegjennomsnitt på 2.

En siste merknad om skanning: hydroksyapatitt kalibreringsfantomer bør skannes med de samme skanneinnstillingene som eksperimentelle bein for å muliggjøre konvertering av dempingskoeffisienter til mineraltetthet i g / cm³⁵. Denne protokollen bruker fantomer på 0,25 g / cm3 og 0,75 g /^cm3 hydroksyapatitt, selv om forskjellige fantomer er tilgjengelige. Vær oppmerksom på at noen skannesystemer bruker interne fantomer som en del av den daglige systemkalibreringen.

Når skanningen er fullført, blir vinkelprojeksjonene rekonstruert til tverrsnittsbilder av objektet, vanligvis ved hjelp av produsentens medfølgende programvare. Uansett hvilket system som brukes, er det viktig å sikre at hele beinet er fanget i rekonstruksjonen, og at terskel er satt riktig for å tillate anerkjennelse av bein versus ikke-bein. Etter rekonstruksjon er det viktig å rotere alle skanninger i tre dimensjoner slik at bein er orientert konsekvent og riktig justert med tverraksen, igjen ved hjelp av produsentens programvare.

Etter rotasjon kan interesseregioner (ROI) for analyse velges basert på om kortikale egenskaper, trabekulære egenskaper eller bruddgeometri for mekanisk normalisering er ønsket. For sistnevnte bør ROI velges etter testing ved å måle avstanden fra bruddstedet til den ene enden av beinet og bruke voxelstørrelse for å bestemme den tilsvarende stykkeplasseringen i skannefilen. Den valgte regionen bør være minst 100 μm lang, med bruddpunktet i det omtrentlige sentrum av avkastningen, for å gi tilstrekkelig estimering⁴.

Når ROI er valgt, er det nødvendig med to egenskaper for mekanisk normalisering (for å beregne bøyespenning og belastning): den maksimale avstanden fra den nøytrale bøyeaksen til overflaten der svikt initieres (antas å være overflaten lastet i spenning, bestemt av testoppsettet), og treghetsmomentet rundt den nøytrale aksen, (også avhengig av testoppsett). Denne protokollen anbefaler bruk av en egendefinert kode for å bestemme disse verdiene. For tilgang til koden, kontakt den korresponderende forfatteren direkte eller besøk laboratoriets nettside på https://bbml.et.iupui.edu/ for mer informasjon.

Når μCT-skanningen er fullført, kan mekanisk testing begynne. Bøyetester kan utføres i enten firepunkts eller trepunktskonfigurasjoner. Firepunkts bøyetester foretrekkes, da de eliminerer skjærspenning i beinet mellom lastepunktene, noe som muliggjør ren bøying i dette området³. Benet vil da sprekke på grunn av spenning, noe som skaper en feil som er mer representativ for de sanne bøyeegenskapene til beinet³. Benet må imidlertid belastes på en slik måte at det leverer samme belastning på begge lastepunktene (dette kan forenkles med et svingbart lastehode). I trepunkts bøyetester er det en stor endring i skjærspenning der belastningspunktet møter beinet, noe som fører til at beinet brekker på dette punktet på grunn av skjær, ikke spenning³. ASTM-standarder anbefaler at materialer som bøyes bør ha et lengde-til-bredde-forhold på 16: 1, noe som betyr at lengden på støttespennet skal være 16 ganger større enn bredden på beinet for å minimere påvirkning av skjær ^8,9. Dette er ofte umulig å oppnå når man tester små gnagerbein, så lastespennet blir ganske enkelt gjort så stort som mulig, men med så liten endring i tverrsnittsform som mulig. Videre, når du utfører firepunktsbøyning, bør forholdet mellom lengdene på nedre og øvre spenn være ~ 3: 1⁸, som vanligvis kan oppnås i tibia, men det er vanskelig i kortere lårben. I tillegg gjør de tynnere kortikale veggene i lårbenene dem utsatt for ringtype deformasjon som endrer formen på beintverrsnittet under testen (dette kan fremheves i firepunktstester, da en større kraft er nødvendig for å indusere det samme bøyemomentet sammenlignet med trepunktsbøyning). Derfor vil trepunktsbøying bli brukt for mus femora mens firepunktsbøying vil bli brukt til tibiae gjennom hele denne protokollen.

Til slutt er det viktig å drive studien riktig for statistisk analyse. En generell anbefaling for mekanisk testing er å ha en prøvestørrelse på 10-12 bein per eksperimentell gruppe for å kunne oppdage forskjeller, da noen mekaniske egenskaper, spesielt postyieldparametere, kan være svært variable. I noen tilfeller kan dette bety å starte med en høyere dyreprøvestørrelse gitt slitasje som kan oppstå under studien. Prøvestørrelsesanalyse ved hjelp av eksisterende data bør fullføres før du prøver en studie.

Det er mange begrensninger og antagelser, men bøyetester kan gi ganske nøyaktige resultater, spesielt når relative forskjeller mellom grupper er av interesse. Disse egenskapene, sammen med analyse av trabekulær arkitektur og kortikal morfologi, kan gi bedre innsikt i sykdomstilstander og behandlingsregimer. Hvis vi er forsiktige med de aspektene av eksperimentet som er i vår kontroll (f.eks. høsting, lagring, skanning og testing), kan vi føle oss sikre på at nøyaktige resultater er generert.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen som involverte dyr har blitt godkjent av Indiana University School of Science Institutional Animal and Use Committee (IACUC) før prosedyren. Dyr beskrevet i prosedyren ble avlivet via CO2-inhalasjon etterfulgt av cervikal dislokasjon som et sekundært middel til eutanasi. 1. Høsting, lagring og tining av bein Høsting og lagringPlasser musen ventral side opp. Bruk en skalpell (eller et barberblad elle…

Representative Results

Etter fullført CT-skanning kan de fleste utilstrekkelige skanninger fanges opp i rekonstruksjon. Ofte vil dårlige skanninger ha en høy feiljusteringskompensasjon som er en klar indikator på en feil under skanningen. Det kan imidlertid oppstå feil i andre trinn og kan også føre til unøyaktige data. Disse feilene kan ofte oppdages når de enkelte beregnede arkitektoniske egenskapene undersøkes. Hvis verdier faller langt utenfor rekkevidden til andre i en gruppe, bør skanningen, avkastningen og metoden for å bere…

Discussion

Gjennom hele skanne- og testprosessen er det øyeblikk når feilsøking og optimalisering er passende. Den første av disse oppstår når du skanner bein ved hjelp av μCT. Mens mange systemer kommer med en holder der ett objekt kan holdes og skannes, kan tilpassede holdere fremstilles for å skanne flere bein samtidig. Skanning av flere bein kan være et utmerket poeng for optimalisering, men forsiktighet bør tas gjennom hele skannings- og analyseprosessen for å sikre at artefakter ikke blir indusert. Når røntgenstr…

Materials

CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object