Considerações práticas para o projeto, execução e interpretação de estudos envolvendo testes de flexão óssea total de ossos de roedores
Summary
O teste mecânico de ossos de roedores é um método valioso para extrair informações sobre a suscetibilidade de um osso à fratura. Na falta de compreensão prática adequada, os resultados podem ser superinterpretados ou não ter validade. Este protocolo servirá como um guia para garantir que os ensaios mecânicos sejam realizados com precisão para fornecer dados válidos e funcionais.
Abstract
A fragilidade esquelética que leva à fratura é uma crise de saúde pública americana que resulta em 1,5 milhão de fraturas a cada ano e US$ 18 bilhões em custos diretos de atendimento. A capacidade de compreender os mecanismos subjacentes à doença óssea e a resposta ao tratamento não é apenas desejada, mas crítica. O teste mecânico do osso serve como uma técnica valiosa para entender e quantificar a suscetibilidade de um osso à fratura. Embora esse método pareça simples de executar, conclusões inadequadas e imprecisas podem ser alcançadas se as suposições governantes e as etapas-chave forem desconsideradas pelo usuário. Isso tem sido observado em todas as disciplinas, à medida que os estudos continuam a ser publicados com uso indevido de métodos e interpretação incorreta dos resultados. Este protocolo servirá como um primer para os princípios associados aos ensaios mecânicos juntamente com a aplicação dessas técnicas – desde considerações sobre o tamanho da amostra, passando pela coleta e armazenamento dos tecidos, até a análise e interpretação dos dados. Com isso em mãos, informações valiosas sobre a suscetibilidade de um osso à fratura podem ser obtidas, favorecendo o entendimento tanto para pesquisas acadêmicas quanto para soluções clínicas.
Introduction
O teste mecânico do osso é o principal método para extrair informações funcionais relacionadas à suscetibilidade de um osso à fratura. Em estudos pré-clínicos, várias modalidades de teste podem ser usadas, mas de longe a mais comum é a flexão de ossos longos. Esses testes são fáceis de realizar e podem ser usados em ossos que variam em tamanho de humano a camundongo. Como os camundongos são um dos animais mais comumente estudados em pesquisas pré-clínicas, este protocolo se concentrará em testes de flexão realizados nos fêmures e tíbias de camundongos.
Antes de realizar testes de flexão, os ossos devem ser adequadamente colhidos e armazenados. Os métodos de armazenamento mais comuns têm sido tradicionalmente o congelamento de ossos em gaze embebida em soro fisiológico, o congelamento apenas em soro fisiológico ou a desidratação de ossos em etanol 1. Foi demonstrado que os ossos armazenados em etanol apresentam aumento da rigidez e do módulo de elasticidade e diminuição dos parâmetros de deformação em relação aos armazenados congelados1. Mesmo a reidratação dos ossos antes do teste não recupera essas propriedades de volta aos níveis normais 1. O armazenamento submerso em soro fisiológico pode causar danos ao osso, uma vez que a pressão é exercida à medida que o soro se expande. Além disso, um descongelamento completo da solução seria necessário para remover os ossos para a tomografia microcomputadorizada (μCT). Consequentemente, o congelamento de ossos recém-colhidos em gaze embebida em soro fisiológico tornou-se o método padrão de armazenamento e é recomendado em todo este protocolo.
Como o tamanho e a forma de um osso afetam sua força volumosa e muitos modelos de doenças alteram significativamente o tamanho e a morfologia do osso, princípios de engenharia são usados para normalizar os efeitos do tamanho para produzir propriedades que estimam o comportamento do tecido2. Essa abordagem requer geometria transversal do local da falha, que é mais comumente adquirida usando μCT para criar varreduras dos ossos antes do teste. A μCT é amplamente utilizada devido à sua disponibilidade e alta resolução de imagem. Além disso, contribuições de partes moles não são incluídas, e o exame não requer fixação química ou outras modificações no osso 3,4. Em todas as formas de TC, uma fonte de raios X é focada em um objeto, enquanto um detector do outro lado do objeto mede a energia de raios-X resultante. Isso produz uma sombra radiográfica da amostra que pode ser convertida em uma imagem 3,5. O objeto que está sendo escaneado é girado (ou a fonte de raios X e o detector são girados em torno da amostra), gerando imagens que podem ser reconstruídas em um conjunto de dados tridimensionais representando o objeto5.
A resolução da varredura, ou quão próximos dois objetos podem estar e ainda ser resolvidos individualmente, é controlada alterando o tamanho nominal do voxel ou o tamanho de um pixel na imagem resultante. É geralmente aceito que os objetos devem ter pelo menos duas vezes o tamanho de um único voxel para serem identificados3, mas uma proporção maior permitirá uma maior precisão. Além disso, voxels maiores são mais propensos a efeitos parciais de volume: quando um único voxel contém tecidos de densidades variadas, é atribuída a média dessas densidades, em vez da densidade específica de um único tecido, o que pode levar a uma superestimação ou subestimação das áreas teciduais e da densidade mineral3. Embora esses problemas possam ser atenuados escolhendo tamanhos de voxels menores, o uso de uma resolução mais alta não garante a eliminação de efeitos parciais de volume e pode exigir tempos de varredura mais longos3. Ao escanear ossos ex vivo, um tamanho de voxel de 6-10 μm é geralmente recomendado para avaliar com precisão a arquitetura trabecular de ossos de camundongos. Um tamanho de voxel maior de 10-17 μm pode ser usado para osso cortical, embora o menor tamanho de voxel razoável deva ser usado. Este protocolo usa um tamanho de voxel de 10 μm, que é pequeno o suficiente para diferenciar as principais propriedades trabeculares e minimizar os efeitos parciais de volume sem tempo de varredura extenso.
As configurações de energia de raios X e filtro de energia também devem ser selecionadas cuidadosamente, pois a alta densidade mineral e espessura do tecido ósseo atenua e altera muito o espectro de energia de raios X transmitido. É geralmente assumido que, como o espectro de raios X emitido é equivalente ao espectro que sai do objeto6, o uso de raios X de baixa energia em objetos densos, como o osso, pode levar a um artefato conhecido como endurecimento do feixe7. Recomenda-se uma maior voltagem, de 50-70 kVp, na varredura de amostras ósseas para reduzir a incidência desses artefatos5. Além disso, a inserção de um filtro de energia de alumínio ou cobre cria um feixe de energia mais concentrado, minimizando ainda mais os artefatos 4,7. Um filtro de alumínio de 0,5 mm será utilizado em todo este protocolo.
Finalmente, a etapa de rotação da varredura e o comprimento de rotação (por exemplo, 180°-360°), juntos controlam o número de imagens capturadas, o que determina a quantidade de ruído na varredura final4. A média de vários quadros em cada etapa pode reduzir o ruído, mas pode aumentar o tempo de varredura4. Este protocolo usa uma etapa de rotação de 0,7 graus e uma média de quadro de 2.
Uma observação final sobre a varredura: os simuladores de calibração de hidroxiapatita devem ser escaneados usando as mesmas configurações de varredura que os ossos experimentais para permitir a conversão dos coeficientes de atenuação em densidade mineral em g/cm 3 5. Este protocolo utiliza simuladores de 0,25 g/cm 3 e 0,75 g/cm3 de hidroxiapatita, embora diferentes simuladores estejam disponíveis. Observe que alguns sistemas de varredura usam simuladores internos como parte da calibração diária do sistema.
Uma vez concluída a digitalização, as projeções angulares são reconstruídas em imagens transversais do objeto, normalmente usando o software que acompanha o fabricante. Seja qual for o sistema utilizado, é importante garantir que todo o osso seja capturado na reconstrução e que o limiar seja definido adequadamente para permitir o reconhecimento de osso versus não-osso. Após a reconstrução, é fundamental girar todos os exames em três dimensões para que os ossos sejam orientados de forma consistente e devidamente alinhados com o eixo transversal, novamente utilizando o software do fabricante.
Após a rotação, regiões de interesse (ROI) para análise podem ser selecionadas com base no desejo de propriedades corticais, propriedades trabeculares ou geometria de fratura para normalização mecânica. Para este último, as ROIs devem ser selecionadas após o teste, medindo a distância do local da fratura a uma extremidade do osso e usando o tamanho do voxel para determinar a localização do corte correspondente no arquivo de exame. A região selecionada deve ter pelo menos 100 μm de comprimento, com o ponto de fratura no centro aproximado da ROI, para fornecer estimativa adequada4.
Com as ROIs selecionadas, duas propriedades são necessárias para a normalização mecânica (para calcular a tensão de flexão e a deformação): a distância máxima do eixo neutro de flexão até a superfície onde a falha é iniciada (assumida como sendo a superfície carregada em tensão, determinada pela configuração do teste) e o momento de inércia da área em torno do eixo neutro (também dependente da configuração do teste). Esse protocolo recomenda o uso de um código personalizado para determinar esses valores. Para ter acesso ao código, entre em contato diretamente com o autor correspondente ou visite o site do laboratório em https://bbml.et.iupui.edu/ para obter mais informações.
Uma vez concluída a μCT, os testes mecânicos podem começar. Os testes de flexão podem ser realizados em configurações de quatro ou três pontos. Os ensaios de flexão de quatro pontos são preferidos, pois eliminam a tensão de cisalhamento no osso entre os pontos de carregamento, permitindo que a flexão pura ocorra nessa região3. O osso então se fraturará devido à tensão, criando uma falha mais representativa das verdadeiras propriedades de flexão do osso3. No entanto, o osso deve ser carregado de forma a fornecer a mesma carga em ambos os pontos de carregamento (isso pode ser facilitado com uma cabeça de carga pivotante). Nos ensaios de flexão de três pontos, há uma grande mudança na tensão de cisalhamento onde o ponto de carga encontra o osso, o que faz com que o osso se quebre neste ponto devido ao cisalhamento, e não à tensão3. As normas ASTM recomendam que os materiais submetidos à flexão devem ter uma relação comprimento/largura de 16:1, ou seja, o comprimento do vão de apoio deve ser 16 vezes maior que a largura do osso para minimizar os impactos do cisalhamento 8,9. Isso muitas vezes é impossível de conseguir ao testar pequenos ossos de roedores, então a extensão de carga é simplesmente feita o maior possível, mas com uma mudança tão pequena na forma transversal quanto possível. Além disso, ao realizar a flexão de quatro pontos, a relação entre os comprimentos do vão inferior e superior deve ser de ~3:18, o que geralmente pode ser alcançado na tíbia, mas é difícil no fêmur mais curto. Além disso, as paredes corticais mais finas dos fêmures os tornam suscetíveis à deformação do tipo anel que altera a forma da secção transversal óssea durante o teste (isso pode ser acentuado em testes de quatro pontos, pois é necessária uma força maior para induzir o mesmo momento fletor em comparação com a flexão de três pontos). Portanto, a flexão de três pontos será utilizada para fêmures de camundongos e a flexão de quatro pontos para tíbias durante todo este protocolo.
Finalmente, é importante capacitar adequadamente o estudo para análise estatística. Uma recomendação geral para ensaios mecânicos é ter um tamanho de amostra de 10-12 ossos por grupo experimental para poder detectar diferenças, pois algumas propriedades mecânicas, especialmente parâmetros pós-rendimento, podem ser altamente variáveis. Em alguns casos, isso pode significar começar com um tamanho de amostra animal maior, dado o desgaste que poderia ocorrer durante o estudo. A análise do tamanho da amostra usando dados existentes deve ser concluída antes da tentativa de um estudo.
Existem inúmeras limitações e suposições, mas os testes de flexão podem fornecer resultados bastante precisos, especialmente quando diferenças relativas entre os grupos são de interesse. Essas propriedades, juntamente com a análise da arquitetura trabecular e morfologia cortical, podem fornecer uma melhor compreensão dos estados patológicos e regimes de tratamento. Se forem tomados cuidados com os aspectos do experimento que estão sob nosso controle (por exemplo, colheita, armazenamento, digitalização e teste), podemos ter certeza de que resultados precisos foram gerados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante todo o processo de digitalização e teste, há momentos em que a solução de problemas e a otimização são apropriadas. A primeira delas ocorre ao escanear ossos usando μCT. Enquanto muitos sistemas vêm com um suporte no qual um objeto pode ser mantido e digitalizado, os suportes personalizados podem ser fabricados para digitalizar vários ossos ao mesmo tempo. A varredura de vários ossos pode ser um excelente ponto para otimização, mas deve-se ter cuidado durante todo o processo de digitalização e an?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho realizado para desenvolver este protocolo tem sido apoiado pelo National Institutes of Health [AR072609].
Materials
| CTAn | Bruker | NA | CT Scan Analysis Software |
| DataViewer | Bruker | NA | CT Scan Rotation Software |
| Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a | MathWorks | NA | Coding platform used for data analysis |
| NRecon | Bruker | NA | CT Scan Reconstruction software |
| SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software | Micro Photonics Inc | SKY-016814 | Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object |
References
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