Praktiska överväganden för utformning, utförande och tolkning av studier som omfattar böjningstester av gnagare

Summary

Mekanisk testning av ben från gnagare är en värdefull metod för att få fram information om benets benkänslighet för frakturer. I brist på praktisk förståelse kan resultaten övertolkas eller sakna validitet. Detta protokoll kommer att fungera som en guide för att säkerställa att mekaniska tester utförs korrekt för att ge giltiga och funktionella data.

Abstract

Skelettskörhet som leder till frakturer är en amerikansk folkhälsokris som resulterar i 1,5 miljoner frakturer varje år och 18 miljarder dollar i direkta vårdkostnader. Förmågan att förstå mekanismerna bakom bensjukdom och svaret på behandling är inte bara önskvärd, utan avgörande. Mekanisk testning av ben fungerar som en värdefull teknik för att förstå och kvantifiera ett bens känslighet för frakturer. Även om denna metod verkar enkel att utföra, kan olämpliga och felaktiga slutsatser dras om styrande antaganden och viktiga steg ignoreras av användaren. Detta har observerats inom olika discipliner eftersom studier fortsätter att publiceras med missbruk av metoder och felaktig tolkning av resultat. Detta protokoll kommer att fungera som en primer för de principer som är förknippade med mekanisk testning tillsammans med tillämpningen av dessa tekniker – från överväganden av provstorlek genom vävnadsskörd och lagring, till dataanalys och tolkning. Med detta i handen kan värdefull information om ett bens känslighet för frakturer erhållas, vilket ökar förståelsen för både akademisk forskning och kliniska lösningar.

Introduction

Mekanisk testning av ben är den primära metoden för att extrahera funktionell information relaterad till ett bens känslighet för frakturer. I prekliniska studier kan flera testmodaliteter användas, men den överlägset vanligaste är böjning av långa ben. Dessa tester är enkla att utföra och kan användas på ben som varierar i storlek från människa till mus. Eftersom möss är ett av de mest studerade djuren i preklinisk forskning, kommer detta protokoll att fokusera på böjningstester som utförs på lårbenet och skenbenet hos möss.

Innan böjningstester utförs måste benen skördas och förvaras på rätt sätt. De vanligaste lagringsmetoderna har traditionellt varit att frysa ben i saltindränkt gasväv, frysa i enbart saltlösning eller torka ben i etanol ¹. Ben lagrade i etanol har visat sig ha ökad styvhet och elasticitetsmodul och minskade deformationsparametrar jämfört med de lagrade frysta¹. Inte ens rehydrering av benen före testning återställer dessa egenskaper till normala nivåer ¹. Förvaring nedsänkt i koksaltlösning kan orsaka skador på benet eftersom trycket utövas när saltlösningen expanderar. Dessutom skulle en fullständig upptining av lösningen krävas för att avlägsna benen för mikrodatortomografi (μCT). Frysning av nyskördade ben i saltindränkt gasväv har därför blivit standardlagringsmetoden och rekommenderas i hela detta protokoll.

Eftersom storleken och formen på ett ben påverkar dess bulkstyrka och många sjukdomsmodeller avsevärt förändrar benstorlek och morfologi, används tekniska principer för att normalisera bort effekterna av storlek för att producera egenskaper som uppskattar vävnadens beteende². Detta tillvägagångssätt kräver tvärsnittsgeometri för felplatsen, som oftast förvärvas med hjälp av μCT för att skapa skanningar av benen före testning. μCT används ofta på grund av dess tillgänglighet och höga bildupplösning. Dessutom ingår inte bidrag från mjukvävnad, och skanning kräver inte kemisk fixering eller andra modifieringar av benet ^3,4. I alla former av CT fokuseras en röntgenkälla på ett objekt medan en detektor på andra sidan av objektet mäter den resulterande röntgenenergin. Detta ger en röntgenskugga av provet som kan omvandlas till en bild ^3,5. Objektet som skannas roteras (eller röntgenkällan och detektorn roteras runt provet), vilket genererar bilder som kan rekonstrueras till en tredimensionell datauppsättning som representerar objektet⁵.

Skanningsupplösningen, eller hur nära varandra två objekt kan vara och fortfarande lösas individuellt, styrs genom att ändra den nominella voxelstorleken eller storleken på en pixel i den resulterande bilden. Det är allmänt accepterat att objekt måste vara minst två gånger så stora som en enda voxel för att kunna identifieras³, men ett högre förhållande möjliggör förbättrad precision. Vidare är större voxlar mer benägna att drabbas av partiella volymeffekter: när en enda voxel innehåller vävnader med varierande densitet tilldelas den genomsnittet av dessa densiteter, snarare än den specifika densiteten av en enda vävnad, vilket kan leda till en över- eller underskattning av vävnadsområden och mineraldensitet³. Även om dessa problem kan mildras genom att välja mindre voxelstorlekar, säkerställer användning av en högre upplösning inte eliminering av partiella volymeffekter och kan kräva längre skanningstider³. Vid skanning av ben ex vivo rekommenderas i allmänhet en voxelstorlek på 6-10 μm för att noggrant bedöma den trabekulära arkitekturen hos musben. En större voxelstorlek på 10-17 μm kan användas för kortikalt ben, även om den minsta rimliga voxelstorleken bör användas. Detta protokoll använder en voxelstorlek på 10 μm, vilket är tillräckligt litet för att differentiera viktiga trabekulära egenskaper och minimera partiella volymeffekter utan omfattande skanningstid.

Röntgenenergi och energifilterinställningar måste också väljas noggrant, eftersom den höga mineraltätheten och tjockleken på benvävnaden kraftigt dämpar och förändrar det överförda röntgenenergispektrumet. Det antas allmänt att eftersom det emitterade röntgenspektrumet är ekvivalent med spektrumet som lämnar objektet⁶, kan användning av lågenergiröntgenstrålar på täta föremål som ben leda till en artefakt som kallas strålhärdning⁷. En högre spänning på 50-70 kVp rekommenderas vid skanning av benprover för att minska förekomsten av dessa artefakter⁵. Att sätta in ett energifilter av aluminium eller koppar skapar dessutom en mer koncentrerad energistråle, vilket ytterligare minimerar artefakter ^4,7. Ett 0,5 mm aluminiumfilter kommer att användas under hela detta protokoll.

Slutligen styr skanningens rotationssteg och rotationslängd (t.ex. 180°-360°) tillsammans antalet bilder som tas, vilket bestämmer mängden brus i den slutliga skanningen⁴. Att ta ett genomsnitt av flera bildrutor i varje steg kan minska bruset men kan öka skanningstiden⁴. Detta protokoll använder ett rotationssteg på 0,7 grader och en bildruta på i genomsnitt 2.

En sista anmärkning om skanning: hydroxiapatitkalibreringsfantomer bör skannas med samma skanningsinställningar som experimentbenen för att möjliggöra omvandling av dämpningskoefficienter till mineraldensitet i g/cm³⁵. Detta protokoll använder fantomer på 0,25 g/cm3 och 0,75 g/^cm3 hydroxiapatit, även om olika fantomer finns tillgängliga. Observera att vissa skanningssystem använder interna fantomer som en del av den dagliga systemkalibreringen.

När skanningen är klar rekonstrueras vinkelprojektionerna till tvärsnittsbilder av objektet, vanligtvis med hjälp av tillverkarens medföljande programvara. Oavsett vilket system som används är det viktigt att se till att hela benet fångas upp i rekonstruktionen och att tröskelvärden sätts på lämpligt sätt för att möjliggöra igenkänning av ben kontra icke-ben. Efter rekonstruktionen är det viktigt att rotera alla skanningar i tre dimensioner så att benen orienteras konsekvent och korrekt i linje med den tvärgående axeln, återigen med hjälp av tillverkarens programvara.

Efter rotation kan regioner av intresse (ROI) för analys väljas baserat på om kortikala egenskaper, trabekulära egenskaper eller frakturgeometri för mekanisk normalisering önskas. För det senare bör ROI väljas efter testning genom att mäta avståndet från frakturstället till ena änden av benet och använda voxelstorlek för att bestämma motsvarande skivplats i skanningsfilen. Det valda området bör vara minst 100 μm långt, med brottpunkten i den ungefärliga mitten av ROI, för att ge adekvat uppskattning⁴.

Med ROI vald behövs två egenskaper för mekanisk normalisering (för att beräkna böjspänning och töjning): det maximala avståndet från den neutrala böjaxeln till ytan där fel initieras (antas vara ytan som belastas i spänning, bestäms av testuppställningen) och tröghetsmomentet runt den neutrala axeln (också beroende på testinställningen). Det här protokollet rekommenderar att du använder en anpassad kod för att fastställa dessa värden. För att få tillgång till koden, kontakta corresponding author direkt eller besök labbets webbplats på https://bbml.et.iupui.edu/ för mer information.

När μCT-skanningen har slutförts kan mekanisk testning påbörjas. Böjtester kan utföras i antingen fyrpunkts- eller trepunktskonfigurationer. Fyrpunktsböjningstester är att föredra eftersom de eliminerar skjuvspänning i benet mellan belastningspunkterna, vilket gör att ren böjning kan ske i denna region³. Benet kommer då att spricka på grund av spänning, vilket skapar ett fel som är mer representativt för de verkliga böjningsegenskaperna hos benet³. Benet måste dock belastas på ett sådant sätt att det ger samma belastning vid båda belastningspunkterna (detta kan underlättas med ett svängbart lasthuvud). I trepunktsböjningstester sker en stor förändring i skjuvspänningen där belastningspunkten möter benet, vilket gör att benet går sönder vid denna punkt på grund av skjuvning, inte spänning³. ASTM-standarder rekommenderar att material som genomgår böjning bör ha ett längd-till-bredd-förhållande på 16:1, vilket innebär att längden på stödspannet bör vara 16 gånger större än benets bredd för att minimera påverkan av skjuvning ^8,9. Detta är ofta omöjligt att uppnå när man testar ben från små gnagare, så belastningsspannet görs helt enkelt så stort som möjligt men med en så liten förändring i tvärsnittsform som möjligt. Dessutom, när man utför fyrpunktsböjning, bör förhållandet mellan längderna på det nedre och övre spannet vara ~3:1⁸, vilket vanligtvis kan uppnås i skenbenet, men det är svårt i det kortare lårbenet. Dessutom gör de tunnare kortikala väggarna i lårbenen dem mottagliga för deformation av ringtyp, vilket ändrar formen på bentvärsnittet under testet (detta kan accentueras i fyrpunktstester eftersom en större kraft krävs för att inducera samma böjmoment jämfört med trepunktsböjning). Därför kommer trepunktsböjning att användas för muslårben medan fyrpunktsböjning kommer att användas för skenben under hela detta protokoll.

Slutligen är det viktigt att driva studien på rätt sätt för statistisk analys. En allmän rekommendation för mekanisk testning är att ha en provstorlek på 10-12 ben per experimentgrupp för att kunna upptäcka skillnader, eftersom vissa mekaniska egenskaper, särskilt postyield-parametrar, kan vara mycket varierande. I vissa fall kan detta innebära att man börjar med en högre djururvalsstorlek med tanke på den bortfall som kan inträffa under studien. Analys av provstorlek med hjälp av befintliga data bör slutföras innan en studie görs.

Det finns många begränsningar och antaganden, men böjningstester kan ge ganska exakta resultat, särskilt när relativa skillnader mellan grupper är av intresse. Dessa egenskaper, tillsammans med analys av trabekulär arkitektur och kortikal morfologi, kan ge bättre insikt i sjukdomstillstånd och behandlingsregimer. Om vi är noga med de aspekter av experimentet som vi har kontroll över (t.ex. skörd, lagring, skanning och testning) kan vi känna oss säkra på att korrekta resultat har genererats.

Protocol

Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll och som involverar djur har godkänts av Indiana University School of Science Institutional Animal and Use Committee (IACUC) före proceduren. Djur som beskrevs i proceduren avlivades via CO2-inandning följt av cervikal luxation som en sekundär metod för avlivning. 1. Skörd, lagring och upptining av ben Skörd och lagringPlacera musen med den ventrala sidan uppåt. Använd en skalpell (eller ett ra…

Representative Results

Efter avslutad datortomografi kan de flesta otillräckliga skanningar fångas upp i rekonstruktionen. Ofta har dåliga skanningar en hög feljusteringskompensation som är en tydlig indikator på ett fel under skanningen. Fel kan dock uppstå i andra steg och kan också leda till felaktiga uppgifter. Dessa fel kan ofta upptäckas när de enskilda beräknade arkitektoniska egenskaperna undersöks. Om värdena ligger långt utanför intervallet för andra i en grupp bör genomsökningen, ROI och metoden för att beräkna e…

Discussion

Under hela skannings- och testprocessen finns det tillfällen då felsökning och optimering är lämpliga. Den första av dessa inträffar vid skanning av ben med hjälp av μCT. Medan många system kommer med en hållare där ett föremål kan hållas och skannas, kan anpassade hållare tillverkas för att skanna flera ben samtidigt. Genomsökning av flera ben kan vara en utmärkt punkt för optimering, men försiktighet bör iakttas under hela skannings- och analysprocessen för att säkerställa att artefakter inte i…

Materials

CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object