Kemirgen kemiklerinin tüm kemik bükme testlerini içeren çalışmaların tasarımı, yürütülmesi ve yorumlanması için pratik hususlar
Summary
Kemirgen kemiklerinin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili bilgileri çıkarmak için değerli bir yöntemdir. Uygun pratik anlayıştan yoksun olarak, sonuçlar aşırı yorumlanabilir veya geçerlilikten yoksun olabilir. Bu protokol, geçerli ve işlevsel veriler sağlamak için mekanik testlerin doğru bir şekilde yapılmasını sağlamak için bir kılavuz görevi görecektir.
Abstract
Kırılmaya yol açan iskelet kırılganlığı, her yıl 1,5 milyon kırık ve 18 milyar dolarlık doğrudan bakım maliyeti ile sonuçlanan bir Amerikan halk sağlığı krizidir. Kemik hastalığının altında yatan mekanizmaları ve tedaviye yanıtı anlama yeteneği sadece arzu edilen değil, aynı zamanda kritiktir. Kemiğin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığını anlamak ve ölçmek için değerli bir teknik olarak hizmet eder. Bu yöntemin gerçekleştirilmesi basit görünse de, geçerli varsayımlar ve temel adımlar kullanıcı tarafından göz ardı edilirse uygunsuz ve yanlış sonuçlara varılabilir. Bu, yöntemlerin yanlış kullanımı ve sonuçların yanlış yorumlanması ile çalışmalar yayınlanmaya devam ettikçe disiplinler arasında gözlemlenmiştir. Bu protokol, mekanik testlerle ilgili ilkeler ve bu tekniklerin uygulanmasıyla birlikte – numune boyutunun dikkate alınmasından doku toplama ve depolamaya, veri analizi ve yorumlanmasına kadar – için bir astar görevi görecektir. Bununla birlikte, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili değerli bilgiler elde edilebilir ve hem akademik araştırmalar hem de klinik çözümler için daha iyi anlaşılabilir.
Introduction
Kemiğin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili fonksiyonel bilgileri çıkarmak için birincil yöntemdir. Klinik öncesi çalışmalarda, çeşitli test yöntemleri kullanılabilir, ancak en yaygın olanı uzun kemiklerin bükülmesidir. Bu testlerin gerçekleştirilmesi kolaydır ve insandan fareye kadar değişen boyutlarda kemikler üzerinde kullanılabilir. Fareler, klinik öncesi araştırmalarda en sık çalışılan hayvanlardan biri olduğundan, bu protokol, farelerin femora ve tibiaları üzerinde yapılan bükme testlerine odaklanacaktır.
Bükme testleri yapılmadan önce kemikler uygun şekilde alınmalı ve saklanmalıdır. En yaygın saklama yöntemleri geleneksel olarak kemiklerin tuzlu suya batırılmış gazlı bezde dondurulması, tek başına tuzlu suda dondurulması veya kemiklerin etanol 1 içinde kurutulması olmuştur. Etanolde depolanan kemiklerin, donmuş olarak depolananlara kıyasla sertlik ve elastik modülün arttığı ve deformasyon parametrelerinin azaldığı gösterilmiştir1. Testten önce kemikleri yeniden sulandırmak bile bu özellikleri normal seviyelere geri getirmez 1. Tuzlu suya batırılmış olarak depolamak, salin genişledikçe basınç uygulandığından kemiğe zarar verebilir. Ek olarak, mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) taraması için kemikleri çıkarmak için çözeltinin tamamen çözülmesi gerekecektir. Sonuç olarak, taze hasat edilmiş kemiklerin tuzlu suya batırılmış gazlı bezde dondurulması standart saklama yöntemi haline gelmiştir ve bu protokol boyunca tavsiye edilir.
Bir kemiğin büyüklüğü ve şekli kütle kuvvetini etkilediğinden ve birçok hastalık modeli kemik boyutunu ve morfolojisini önemli ölçüde değiştirdiğinden, dokunun davranışını tahmin eden özellikler üretmek için boyutun etkilerini normalleştirmek için mühendislik ilkeleri kullanılır2. Bu yaklaşım, testten önce kemiklerin taramalarını oluşturmak için en yaygın olarak μCT kullanılarak elde edilen başarısızlık yerinin enine kesit geometrisini gerektirir. μCT, kullanılabilirliği ve yüksek görüntü çözünürlüğü nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, yumuşak dokunun katkıları dahil değildir ve tarama, kemiğe kimyasal fiksasyon veya başka değişiklikler gerektirmez 3,4. Tüm CT formlarında, bir X-ışını kaynağı bir nesneye odaklanırken, nesnenin diğer tarafındaki bir dedektör ortaya çıkan X-ışını enerjisini ölçer. Bu, numunenin bir görüntüyedönüştürülebilen bir X-ışını gölgesi üretir 3,5. Taranan nesne döndürülür (veya X-ışını kaynağı ve dedektör numunenin etrafında döndürülür), nesneyi temsil eden üç boyutlu bir veri setine yeniden oluşturulabilen görüntüler üretilir5.
Tarama çözünürlüğü veya iki nesnenin birbirine ne kadar yakın olabileceği ve yine de ayrı ayrı çözümlenebileceği, elde edilen görüntüdeki nominal voksel boyutu veya bir pikselin boyutu değiştirilerek kontrol edilir. Genel olarak, nesnelerin tanımlanması için tek bir vokselin en az iki katı büyüklüğünde olması gerektiğikabul edilir 3, ancak daha yüksek bir oran daha fazla hassasiyet sağlayacaktır. Ayrıca, daha büyük vokseller kısmi hacim etkilerine daha yatkındır: tek bir voksel farklı yoğunluklarda dokular içerdiğinde, tek bir dokunun özgül yoğunluğundan ziyade bu yoğunlukların ortalamasına atanır, bu da doku alanlarının ve mineral yoğunluğunun fazla veya eksik tahmin edilmesine yol açabilir3. Bu sorunlar daha küçük voksel boyutları seçilerek hafifletilebilse de, daha yüksek bir çözünürlük kullanmak kısmi hacim etkilerinin ortadan kaldırılmasını sağlamaz ve daha uzun tarama süreleri gerektirebilir3. Kemikleri ex vivo olarak tararken, fare kemiklerinin trabeküler mimarisini doğru bir şekilde değerlendirmek için genellikle 6-10 μm’lik bir voksel boyutu önerilir. Kortikal kemik için 10-17 μm’lik daha büyük bir voksel boyutu kullanılabilir, ancak en küçük makul voksel boyutu kullanılmalıdır. Bu protokol, temel trabeküler özellikleri ayırt etmek ve kapsamlı tarama süresi olmadan kısmi hacim etkilerini en aza indirmek için yeterince küçük olan 10 μm’lik bir voksel boyutu kullanır.
Kemik dokusunun yüksek mineral yoğunluğu ve kalınlığı, iletilen X-ışını enerji spektrumunu büyük ölçüde zayıflattığı ve değiştirdiği için X-ışını enerjisi ve enerji filtresi ayarları da dikkatli bir şekilde seçilmelidir. Genel olarak, yayılan X-ışını spektrumunun nesne6’dan çıkan spektruma eşdeğer olduğu için, kemik gibi yoğun nesneler üzerinde düşük enerjili X-ışınlarının kullanılmasının, ışın sertleşmesi7 olarak bilinen bir artefakta yol açabileceği varsayılır. Bu artefaktların insidansını azaltmak için kemik örneklerini tararken 50-70 kVp’lik daha yüksek bir voltaj önerilir5. Ek olarak, bir alüminyum veya bakır enerji filtresinin takılması, daha konsantre bir enerji ışını oluşturarak artefaktları daha da en aza indirir 4,7. Bu protokol boyunca 0,5 mm alüminyum filtre kullanılacaktır.
Son olarak, tarama döndürme adımı ve döndürme uzunluğu (örneğin, 180°-360°), son taramadaki gürültü miktarını belirleyenyakalanan görüntü sayısını birlikte kontrol eder 4. Her adımda birden fazla karenin ortalamasını almak gürültüyü azaltabilir ancak tarama süresini artırabilir4. Bu protokol, 0,7 derecelik bir döndürme adımı ve 2 derecelik bir çerçeve ortalaması kullanır.
Tarama hakkında son bir not: hidroksiapatit kalibrasyon fantomları, zayıflama katsayılarının g/cm35 cinsinden mineral yoğunluğuna dönüştürülmesini sağlamak için deneysel kemiklerle aynı tarama ayarları kullanılarak taranmalıdır. Bu protokol, farklı fantomlar mevcut olmasına rağmen, 0.25 g/cm3 ve 0.75 g/cm3 hidroksiapatit fantomları kullanır. Bazı tarama sistemlerinin, günlük sistem kalibrasyonunun bir parçası olarak dahili fantomlar kullandığını unutmayın.
Tarama tamamlandıktan sonra, açısal çıkıntılar, tipik olarak üreticinin eşlik eden yazılımı kullanılarak nesnenin kesit görüntülerine dönüştürülür. Hangi sistem kullanılırsa kullanılsın, rekonstrüksiyonda tüm kemiğin yakalandığından ve eşiğin kemik ile kemik olmayanın tanınmasına izin verecek şekilde uygun şekilde ayarlandığından emin olmak önemlidir. Rekonstrüksiyondan sonra, tüm taramaları üç boyutlu olarak döndürmek çok önemlidir, böylece kemikler yine üreticinin yazılımını kullanarak enine eksenle tutarlı ve düzgün bir şekilde hizalanır.
Rotasyonu takiben, mekanik normalizasyon için kortikal özellikler, trabeküler özellikler veya kırılma geometrisinin istenip istenmediğine bağlı olarak analiz için ilgi alanları (ROI) seçilebilir. İkincisi için, kırık bölgesinden kemiğin bir ucuna olan mesafeyi ölçerek ve tarama dosyasında karşılık gelen dilim konumunu belirlemek için voksel boyutu kullanılarak test edildikten sonra ROI’ler seçilmelidir. Seçilen bölge en az 100 μm uzunluğunda olmalı ve kırılma noktası ROI’nin yaklaşık merkezinde olmalıdır4.
ROI’ler seçildiğinde, mekanik normalizasyon için iki özellik gereklidir (eğilme gerilimini ve gerinimini hesaplamak için): nötr eğilme ekseninden arızanın başlatıldığı yüzeye olan maksimum mesafe (test kurulumu tarafından belirlenen, gerilimde yüklü yüzey olduğu varsayılır) ve nötr eksen etrafındaki atalet momenti alanı (ayrıca test kurulumuna bağlıdır). Bu protokol, bu değerleri belirlemek için özel bir kod kullanılmasını önerir. Koda erişmek için doğrudan ilgili yazarla iletişime geçin veya daha fazla bilgi için https://bbml.et.iupui.edu/ adresindeki laboratuvar web sitesini ziyaret edin.
μCT taraması tamamlandıktan sonra mekanik test başlayabilir. Bükme testleri, dört noktalı veya üç noktalı konfigürasyonlarda gerçekleştirilebilir. Dört noktalı eğilme testleri, yükleme noktaları arasındaki kemikteki kayma gerilmesini ortadan kaldırdığı ve bu bölgede saf eğilmenin gerçekleşmesine olanak sağladığı için tercih edilmektedir3. Kemik daha sonra gerginlik nedeniyle kırılacak ve kemiğin gerçek bükülme özelliklerini daha iyi temsil eden bir başarısızlık yaratacaktır3. Bununla birlikte, kemik, her iki yükleme noktasında da aynı yükü verecek şekilde yüklenmelidir (bu, döner bir yükleme kafası ile kolaylaştırılabilir). Üç nokta eğilme testlerinde, yük noktasının kemikle birleştiği yerde kayma gerilmesinde büyük bir değişiklik olur ve bu da kemiğin bu noktada gerilme3 değil kayma nedeniyle kırılmasına neden olur. ASTM standartları, bükülmeye maruz kalan malzemelerin uzunluk-genişlik oranının 16:1 olmasını önermektedir,yani kesme 8,9 etkilerini en aza indirmek için destek açıklığının uzunluğu kemiğin genişliğinden 16 kat daha büyük olmalıdır. Küçük kemirgen kemiklerini test ederken bunu başarmak genellikle imkansızdır, bu nedenle yükleme aralığı mümkün olduğunca büyük, ancak enine kesit şeklinde mümkün olduğunca küçük bir değişiklikle yapılır. Ayrıca, dört noktalı bükme yapılırken, alt ve üst açıklığın uzunlukları arasındaki oran ~3:18 olmalıdır, bu genellikle tibiada elde edilebilir, ancak daha kısa femurda zordur. Ek olarak, femurların daha ince kortikal duvarları, onları test sırasında kemik kesitinin şeklini değiştiren halka tipi deformasyona duyarlı hale getirir (bu, üç noktalı bükülmeye kıyasla aynı bükülme momentini indüklemek için daha büyük bir kuvvet gerektiğinden dört noktalı testlerde vurgulanabilir). Bu nedenle, bu protokol boyunca fare femora için üç noktalı bükme kullanılırken, tibia için dört noktalı bükme kullanılacaktır.
Son olarak, istatistiksel analiz için çalışmayı uygun şekilde güçlendirmek önemlidir. Mekanik testler için genel bir öneri, bazı mekanik özellikler, özellikle akma sonrası parametreler oldukça değişken olabileceğinden, farklılıkları tespit edebilmek için deney grubu başına 10-12 kemiklik bir örneklem büyüklüğüne sahip olmaktır. Bazı durumlarda, bu, çalışma sırasında meydana gelebilecek yıpranma göz önüne alındığında daha yüksek bir hayvan örneklem büyüklüğü ile başlamak anlamına gelebilir. Bir çalışmaya başlamadan önce mevcut veriler kullanılarak örneklem büyüklüğü analizi tamamlanmalıdır.
Çok sayıda sınırlama ve varsayım vardır, ancak bükme testleri, özellikle gruplar arasındaki göreceli farklılıklar söz konusu olduğunda oldukça doğru sonuçlar verebilir. Bu özellikler, trabeküler mimari ve kortikal morfolojinin analizi ile birlikte, hastalık durumları ve tedavi rejimleri hakkında daha iyi bilgi sağlayabilir. Deneyin kontrolümüzde olan yönlerine (örneğin, hasat, depolama, tarama ve test etme) dikkat edilirse, doğru sonuçların üretildiğinden emin olabiliriz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tarama ve test süreci boyunca, sorun giderme ve optimizasyonun uygun olduğu anlar vardır. Bunlardan ilki, μCT kullanarak kemikleri tararken ortaya çıkar. Birçok sistem, bir nesnenin tutulabileceği ve taranabileceği bir tutucu ile birlikte gelirken, aynı anda birden fazla kemiği taramak için özel tutucular üretilebilir. Birden fazla kemiğin taranması optimizasyon için mükemmel bir nokta olabilir, ancak artefaktların indüklenmediğinden emin olmak için tarama ve analiz süreci boyunca dikkatli olunmal?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu protokolü geliştirmek için yapılan çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir [AR072609].
Materials
| CTAn | Bruker | NA | CT Scan Analysis Software |
| DataViewer | Bruker | NA | CT Scan Rotation Software |
| Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a | MathWorks | NA | Coding platform used for data analysis |
| NRecon | Bruker | NA | CT Scan Reconstruction software |
| SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software | Micro Photonics Inc | SKY-016814 | Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object |
References
- Vesper, E. O., Hammond, M. A., Allen, M. R., Wallace, J. M. Even with rehydration, preservation in ethanol influences the mechanical properties of bone and how bone responds to experimental manipulation. Bone. 97, 49-53 (2017).
- Jepsen, K. J., Silva, M. J., Vashishth, D., Guo, X. E., van der Meulen, M. C. Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).
- Eds Burr, D. B., Allen, M. R. . Basic and Applied Bone Biology. , (2019).
- . . microCT SkyScan 1272 User Manual. , (2018).
- Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. MicroCT for scanning and analysis of mouse bones. Methods in Molecular Biology. 2230, 169-198 (2021).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- . . Micro-CT specimen scanner, Centre for high-throughput phenogenomics. , (2023).
- ASTM International. . Standard test method for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials by four-point bending. , (2020).
- ASTM International. . Standard test methods for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials. , (2017).
- . Bruker microCT NRecon: An overview. , (2023).
