במאמר זה אנו מציגים את ההפקה וההכנה של מטבוליטים קוטביים וקוטביים למחצה מהולובונט אלמוגים, כמו גם רקמת מארח אלמוגים מופרדת ושברי תאים Symbiodiniaceae, לצורך ניתוח ספקטרומטריית מסות של כרומטוגרפיית גז.
גישות המבוססות על ספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה של גז (GC-MS) הוכיחו את עצמן כחזקות להבהרת הבסיס המטבולי של סימביוזה cnidarian-dinoflagellate וכיצד אלמוגים מגיבים ללחץ (כלומר, במהלך הלבנה הנגרמת על ידי טמפרטורה). פרופיל מטבוליטים במצב יציב של הולוביונט האלמוגים, הכולל את הפונדקאי הקנידריאני ואת המיקרובים הקשורים אליו (Symbiodiniaceae ופרוטיסטים אחרים, חיידקים, ארכאה, פטריות ווירוסים), יושם בהצלחה בתנאי סביבה ועקה כדי לאפיין את המצב המטבולי ההוליסטי של האלמוג.
עם זאת, כדי לענות על שאלות סביב אינטראקציות סימביוטיות, יש צורך לנתח את פרופילי המטבוליטים של מארח האלמוגים וסימביונטות האצות שלו באופן עצמאי, אשר ניתן להשיג רק על ידי הפרדה פיזית ובידוד של הרקמות, ואחריו מיצוי עצמאי וניתוח. בעוד היישום של מטבולומיקה הוא חדש יחסית בתחום האלמוגים, המאמצים המתמשכים של קבוצות מחקר הביאו לפיתוח שיטות חזקות לניתוח מטבוליטים באלמוגים, כולל הפרדת הרקמה המארחת של האלמוגים וסימביונטים של אצות.
מאמר זה מציג מדריך שלב אחר שלב להפרדת הולוביונט ומיצוי מטבוליטים לניתוח GC-MS, כולל שלבי אופטימיזציה מרכזיים שיש לקחת בחשבון. אנו מדגימים כיצד, לאחר ניתוח עצמאי, פרופיל המטבוליטים המשולב של שני השברים (אלמוגים ו- Symbiodiniaceae) דומה לפרופיל של השלם (holobiont), אך על ידי הפרדת הרקמות, אנו יכולים גם לקבל מידע מפתח על חילוף החומרים והאינטראקציות בין שני השותפים שלא ניתן להשיג מהשלם בלבד.
מטבוליטים מייצגים את התוצרים הסופיים של תהליכים תאיים, ומטבולומיקה – המחקר של חבילת המטבוליטים המיוצרים על ידי אורגניזם או מערכת אקולוגית נתונה – יכולה לספק מדד ישיר לתפקוד אורגניזם1. זה קריטי במיוחד לחקר מערכות אקולוגיות, אינטראקציות סימביוטיות וכלי שיקום, שכן המטרה של רוב אסטרטגיות הניהול היא לשמר (או לשחזר) פונקציות ספציפיות של שירותי מערכת אקולוגית2. שוניות אלמוגים הן מערכת אקולוגית מימית אחת המדגימה את הערך הפוטנציאלי של מטבולומיקה להבהרת אינטראקציות סימביוטיות ולקישור תגובות פיזיולוגיות של אלמוגים להשפעות ברמת הקהילה וברמת המערכת האקולוגית3. היישום של ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז בתפוקה גבוהה (GC-MS) מוערך במיוחד בשל יכולתו לנתח במהירות מגוון רחב של סוגי מטבוליטים בו זמנית עם סלקטיביות ורגישות גבוהות, לספק זיהוי מורכב מהיר כאשר ספריות ספקטרליות זמינות, ולספק רמה גבוהה של שחזור ודיוק, עם עלות נמוכה יחסית לדגימה.
אלמוגים הם הולוביונטים המורכבים מחיית האלמוגים, אנדוסימביונטים פוטוסינתטיים של דינופלגלאט (משפחה: Symbiodiniaceae4), ומיקרוביוםמורכב 5,6. באופן כללי, הכושר של ההולוביונט נשמר בעיקר באמצעות חילופי מולקולות ואלמנטים קטנים כדי לתמוך בתפקוד המטבולי של כל חבר 7,8,9,10. גישות מטבולומיות הוכחו כחזקות במיוחד להבהרת הבסיס המטבולי של ספציפיות סימביוזה 9,11, תגובת הלבנה לעקה תרמית7,8,12,13, תגובות מחלה 14, תגובות חשיפה לזיהום 15, פוטואקלום 16 ואיתות כימי 17 באלמוגים, כמו גם סיוע בגילוי סמנים ביולוגיים 18,19. בנוסף, מטבולומיקה יכולה לספק אישור רב ערך למסקנות שהוסקו מטכניקות מבוססות DNA ו- RNA 9,20. קיים אפוא פוטנציאל רב לשימוש במטבולומיקה להערכת בריאות השונית ולפיתוח כלים לשימור שוניות3, כגון באמצעות איתור סמנים ביולוגיים מטבוליים של עקה18,19 ולבחינת הפוטנציאל של אסטרטגיות ניהול אקטיבי כגון סובסידיות תזונתיות21.
הפרדת התאים המארח והסימביונט וניתוח פרופילי המטבוליטים שלהם באופן עצמאי, ולא יחד כהולוביונט, יכולים להניב מידע נוסף על אינטראקציות בין בני הזוג, סטטוסים פיזיולוגיים ומטבוליים עצמאיים, ומנגנונים מולקולריים פוטנציאליים להסתגלות 11,12,22,23,24. מבלי להפריד בין האלמוגים לבין Symbiodiniaceae, כמעט בלתי אפשרי להבהיר את תרומתם וחילוף החומרים של אלמוגים ו / או Symbiodiniaceae באופן עצמאי, למעט שחזור גנום מורכב ומידול מטבולי25, אך זה עדיין לא יושם על סימביוזה אלמוג-dinoflagellate. יתר על כן, ניסיון לחלץ מידע על חילוף החומרים האישי של הפונדקאי או סימביונט אצות מפרופיל המטבוליטים של ההולוביונט יכול להוביל לפרשנות שגויה.
לדוגמה, עד לאחרונה, הנוכחות של חומצות שומן רב בלתי רוויות C18:3n-6, C18:4n-3 ו-C16 בתמציות מרקמות אלמוגים והולוביונט נחשבה כנגזרת מסימביונט האצות, שכן ההנחה הייתה שלאלמוגים אין את ωx desaturases החיוני לייצור חומצות שומן אומגה-3 (ω3); עם זאת, ראיות גנומיות עדכניות מצביעות על כך שלקנידארים מרובים יש את היכולת לייצר ω3 PUFA de novo ולבצע ביוסינתזה נוספת של ω3 PUFA26 ארוך שרשרת. שילוב GC-MS עם תיוג איזוטופי יציב (למשל, 13 C-ביקרבונט, NaH 13CO 3) יכול לשמשלמעקב אחר גורלו של פחמן קבוע פוטוסינתטי באמצעות רשתות מטבוליות הולוביונט אלמוגים הן בתנאי בקרה והן בתגובה לגורמי עקה חיצוניים27,28. עם זאת, שלב קריטי במעקב אחר גורל 13 C הוא הפרדת רקמת האלמוג מתאי האצות – רק אז ניתן להקצות באופן חד משמעי נוכחות של תרכובת המסומנת ב-13C בחלק המארח של האלמוגים כמטבוליט שמקורו ב-Symbiodiniaceae המועתק לאלמוג או כתוצר במורד הזרם של תרכובת מסומנת שעברה. טכניקה זו הוכיחה את כוחה על ידי קריאת תיגר על ההנחה ארוכת השנים כי גליצרול הוא הצורה העיקרית שבה פוטוסינתאט מועבר מסימביונט למארח29, כמו גם הבהרה כיצד שטף תזונתי בין שותפים משתנה במהלך הלבנה27,28 ובתגובה למיני Symbiodiniaceae11 שאינם תואמים.
בעוד שההחלטה להפריד רקמות מונעת בעיקר על ידי שאלת המחקר, חשוב לקחת בחשבון את המעשיות, האמינות וההשפעות המטבוליות הפוטנציאליות של גישה זו. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות ומוכחות להפקת מטבוליטים מההולוביונט, כמו גם את השברים המארח והסימביונט הנפרדים. אנו משווים את פרופילי המטבוליטים של המארח והסימביונט באופן עצמאי וכיצד פרופילים אלה בהשוואה לפרופיל המטבוליט של הולוביונט.
ההפרדה בין הפונדקאי לסימביונט ניתנת להשגה בקלות ובמהירות באמצעות צנטריפוגה פשוטה, והתוצאות כאן מראות כי הפרדת השברים יכולה לספק מידע רב ערך המעיד על תרומות ספציפיות של חברי הולוביונט, אשר יכול לתרום לניתוח פונקציונלי של בריאות האלמוגים. באלמוגים בוגרים, סינתזת שומנים מבוצעת בעיקר ע…
The authors have nothing to disclose.
J.L.M. נתמך על ידי מלגת מחקר של UTS Chancellor.
100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
DMF | Merck | RTC000098 | |
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
Primer | v4 | ||
R | v4.1.2 | ||
Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
tidyverse | v1.3.1 | R package | |
TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |