Affiniteitszuivering van een fibrinolytisch enzym van Sipunculus nudus
Summary
Hier presenteren we een affiniteitszuiveringsmethode van een fibrinolytisch enzym van Sipunculus nudus die eenvoudig, goedkoop en efficiënt is.
Abstract
Het fibrinolytische enzym van Sipunculus nudus (sFE) is een nieuw fibrinolytisch middel dat zowel plasminogeen tot plasmine kan activeren als fibrine direct kan afbreken, wat grote voordelen biedt ten opzichte van traditionele trombolytische middelen. Vanwege het gebrek aan structurele informatie zijn alle zuiveringsprogramma’s voor sFE echter gebaseerd op meerstapschromatografiezuiveringen, die te ingewikkeld en duur zijn. Hier wordt voor het eerst een affiniteitszuiveringsprotocol van sFE ontwikkeld op basis van een kristalstructuur van sFE; het omvat de bereiding van het ruwe monster en de lysine/arginine-agarose matrix affiniteitschromatografiekolom, affiniteitszuivering en karakterisering van de gezuiverde sFE. Volgens dit protocol kan een partij sFE binnen 1 dag worden gezuiverd. Bovendien neemt de zuiverheid en activiteit van de gezuiverde sFE toe tot respectievelijk 92% en 19.200 U/ml. Dit is dus een eenvoudige, goedkope en efficiënte aanpak voor sFE-zuivering. De ontwikkeling van dit protocol is van groot belang voor het verdere gebruik van sFE en andere soortgelijke middelen.
Introduction
Trombose is een grote bedreiging voor de volksgezondheid, vooral na de Covid-19 wereldwijde pandemie 1,2. Klinisch gezien zijn veel plasminogeenactivatoren (PA’s), zoals weefseltype plasminogeenactivator (tPA) en urokinase (VK), op grote schaal gebruikt als trombolytische geneesmiddelen. PA’s kunnen plasminogeen van patiënten activeren tot actief plasmine om fibrine af te breken. Hun trombolytische efficiëntie wordt dus sterk beperkt door de plasminogeenstatus van de patiënten 3,4. Fibrinolytische middelen, zoals metalloproteinase plasmine en serine plasmine, zijn een ander type klinisch trombolytisch geneesmiddel dat ook fibrinolytische enzymen (FE) zoals plasmine bevat, die stolsels direct kunnen oplossen, maar snel worden geïnactiveerd door verschillende plasmineremmers5. Vervolgens is een nieuw type fibrinolytisch middel gemeld dat de trombus kan oplossen door niet alleen het plasminogeen in plasmine te activeren, maar ook het fibrine direct af te breken 6-het fibrinolytische enzym van de oude pindamur Sipunculus nudus (sFE)6. Deze bifunctie geeft sFE andere voordelen ten opzichte van traditionele trombolytische geneesmiddelen, vooral in termen van abnormale plasminogeenstatus. In vergelijking met andere bifunctionele fibrinolytische middelen 7,8,9 vertoont sFE verschillende voordelen, waaronder veiligheid, ten opzichte van van non-food afgeleide middelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, met name voor orale geneesmiddelen. Dit komt omdat de bioveiligheid en biocompatibiliteit van Sipunculus nudus goed zijn vastgesteld10.
Net als de andere natuurlijke fibrinolytische middelen geïsoleerd uit micro-organismen, regenwormen en paddenstoelen, is de zuivering van sFE uit S. nudus zeer gecompliceerd en omvat meerdere stadia, zoals weefselhomogenisatie, ammoniumsulfaatprecipitatie, ontzilting, anionenuitwisselingschromatografie, hydrofobe interactiechromatografie en moleculair zeven10,11,12. Een dergelijk zuiveringssysteem is niet alleen afhankelijk van bekwame vaardigheden en dure materialen, maar vereist ook enkele dagen om de hele procedure te voltooien. Daarom is een eenvoudig zuiveringsprogramma van sFE van groot belang voor de verdere ontwikkeling van sFE. Gelukkig zijn er twee kristallen van sFE (PDB: 8HZP; VOB: 8HZO) met succes zijn verkregen (zie aanvullend dossier 1 en aanvullend dossier 2). Door middel van structurele analyse en moleculaire dockingexperimenten ontdekten we dat de katalytische kern van sFE specifiek kon binden aan doelen die arginine of lysineresiduen bevatten.
Hierin werd voor het eerst een affiniteitszuiveringssysteem voorgesteld, gebaseerd op de kristalstructuur van sFE. Door dit protocol te volgen, kon zeer zuivere en zeer actieve sFE worden gezuiverd uit de ruwe extracten in een enkele affiniteitszuiveringsfase. Het hier ontwikkelde protocol is niet alleen belangrijk voor de grootschalige bereiding van sFE, maar kan ook worden toegepast voor de zuivering van andere fibrinolytische middelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege de onbeschikbaarheid van de exacte gensequentie van sFE, werd de momenteel gebruikte sFE geëxtraheerd uit verse S. nudus14. Bovendien waren de zuiveringsprocedures van sFE die in de literatuur werden gerapporteerd gecompliceerd en kostbaar, omdat ze gebaseerd waren op enkele algemene kenmerken van sFE, zoals molecuulgewicht, iso-elektrisch punt, ionische sterkte en polariteit15,16. Tot op heden is er geen affiniteitszuive…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Science and Technology Bureau van Xiamen City (3502Z20227197) en het Science and Technology Bureau van de provincie Fujian (nr. 2019J01070, nr. 2021Y0027).
Materials
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -. H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
