現在のプロトコルはMCF-7セル拡散および移動の禁止のサリドロシドの薬理学の行為そしてメカニズムを評価するための広範囲の作戦を記述する。
サリドロシド(Sal)には、抗発がん性、抗低酸素性、および抗炎症性の薬理活性が含まれています。.しかし、その根底にある抗乳がんメカニズムは不完全にしか解明されていません。それ故に、このプロトコルは人間の乳癌MCF-7セルの悪性増殖のPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1細道の調整のSalの潜在性を解読するように意図した。まず、MCF-7に対するSalの薬理活性をCCK-8および細胞スクラッチアッセイによって評価した。さらに、MCF-7細胞の耐性は、遊走およびマトリゲル浸潤アッセイによって測定されました。細胞アポトーシスおよびサイクルアッセイでは、MCF-7細胞をそれぞれアネキシンV-FITC/PIおよびフローサイトメトリー解析用の細胞周期染色検出キットを用いて段階的に処理しました。活性酸素種(ROS)およびCa2+のレベルをDCFH-DAおよびFluo-4 AM免疫蛍光染色によって調べました。Na+-K+-ATPaseおよびCa2+-ATPaseの活性は、対応する市販キットを用いて測定した。アポトーシスおよびPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路におけるタンパク質および遺伝子発現レベルは、それぞれウェスタンブロットおよびqRT-PCR解析を用いてさらに決定された。Sal処理は、用量依存的な効果でMCF-7細胞の増殖、遊走、および浸潤を有意に制限することがわかりました。一方、サル投与は、MCF-7細胞を劇的にアポトーシスと細胞周期停止に追いやった。免疫蛍光試験では、SalがMCF-7細胞におけるROSおよびCa2+産生を観察的に刺激することが示されました。さらなるデータにより、Salはアポトーシス促進性タンパク質であるBax、Bim、切断されたカスパーゼ-9/7/3、およびそれらに対応する遺伝子の発現レベルを促進することが確認されました。一貫して、Sal介入は、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、およびFoxO1タンパク質およびそれらに対応する遺伝子の発現を顕著に減少させた。結論として、Salは、PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路を阻害することにより、MCF-7細胞の悪性増殖、遊走、および浸潤を減少させる可能性があるため、乳がんを治療するための潜在的なハーブ由来の化合物として使用できます。
最も一般的に診断されるがんの1つであり、最も一般的な悪性腫瘍の1つである乳がんは、最新の統計によると、2020年までに世界中で230万例が発生し、全がん症例の11.7%を占めています1。乳がんの一般的な症状には、乳房の圧痛とうずき、乳房のしこりと痛み、乳頭の分泌物、びらんまたはくぼんだ皮膚、および腋窩リンパ節の肥大が含まれます1,2。さらに憂慮すべきことに、乳がんの新規患者数と全体的な発生率は毎年圧倒的な速度で増加し続けており、がん関連死の6.9%を占めています1。現在、乳がんの介入は、化学療法、手術、放射線療法、および包括的な治療が中心です。治療は患者の再発率と死亡率を効果的に低下させることができますが、長期治療の適用はしばしば多剤耐性、広範囲の脱毛、吐き気と嘔吐を引き起こし、深刻な精神的および心理的負担を引き起こします2,3。特に、乳がんによる多臓器転移の潜在的なリスクは、薬物療法の新しいハーブ源を探すことを人々に強いています4,5。
ホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)を介したシグナル伝達は、複数の遺伝子の発現に影響を与えるスプライシングを介して、乳がんの増殖、増殖、および生存に関与しています6。PI3Kの下流シグナルセンシングタンパク質として、プロテインキナーゼB(AKT)が哺乳類のラパマイシン標的(mTOR)タンパク質と結合して乳がんをさらに増加させる可能性があることを示唆する多くの証拠があります7,8,9。さらに、PI3K / AKT / mTORシグナル伝達の不活性化は、乳がんの悪性増殖を阻害し、アポトーシスを刺激する薬物の重要な要素であるとも主張されています10,11,12。腫瘍微小環境における極端な低酸素状態は、低酸素誘導性第1因子アルファ(HIF-1α)の大規模な急増を余儀なくされ、乳がんの進行をさらに悪化させることはよく知られています13,14,15。並行して、AKT刺激はHIF-1αの過剰蓄積にもつながり、乳がんサンプルのアポトーシスを制限します16,17。興味深いことに、PI3K-AKT-HIF-1αシグナル伝達の活性化は、肺がん18、大腸がん19、卵巣がん20、前立腺がん21など、さまざまながんの病理学的進行と転移に関与していることが確認されています。HIF-1αによって調整されることに加えて、分岐頭部転写因子1(FoxO1)の過剰発現は、AKTシグナル伝達刺激によっても引き起こされ、乳がん細胞の周期停止とアポトーシスの阻害を促進します22,23。まとめると、上記の確かな証拠は、PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1シグナル伝達のカスケードの阻害が、乳がんにおける薬物療法の潜在的な新規標的である可能性があることを示唆しています。
サリドロシド(Sal)は、抗癌24,25、抗低酸素26,27,28,29、および免疫増強薬理活性30を発揮することが広く実証されています。水に溶けやすい薄茶色または褐色の粉末であり、フェニルエタノイド配糖体の一種であり、化学構造式はC14H 20 O7であり、分子量は300.331,32である。現代の薬理学的研究は、SalがPI3K-AKT-mTORシグナル伝達を抑制することにより、胃癌細胞のアポトーシスを促進することができることを実証している24。さらなる証拠はまた、Sal治療によるPI3K-AKT-HIF-1αシグナル伝達の抑制が、化学療法剤に対する感受性を高めることによって癌細胞のアポトーシスに寄与する可能性があることを示唆しています25。証拠はまた、サルが細胞の移動と浸潤を制限し、ヒト乳がんMCF-7細胞のアポトーシスを促進することによって周期停止を引き起こすことを示唆しています33,34。しかし、SalがPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1シグナル伝達を調節し、MCF-7細胞の悪性増殖を阻害できるかどうかは、まだ不明である。従って、このプロトコルはPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1細道によってMCF-7セル移動、浸潤、細胞周期およびapoptosisに対するSalの効果を探検することを向けた。細胞遊走や浸潤の評価、フローサイトメトリーによるアポトーシスや細胞周期の検出、活性酸素種(ROS)、Ca2+蛍光測定など、従来型の低コストで独立した実験からなる統合研究戦略は、従来の漢方薬を用いた抗がん研究の実験の全体的なデザインの参考となります。本研究の実験過程を図1に示す。
乳がんはあらゆる年齢層に罹患し、計り知れない肉体的・精神的負担と大きな経済的圧力を引き起こします1。また、罹患率や死亡率が年々増加している乳がんは、従来の治療法を超えた効果的なハーブベースの複合療法の模索という点でも世界的に注目されています4,5。有望なことに、多くの証拠がSal 24,25,38<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、四川省衛生健康委員会(120025)の支援を受けました。
1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
Flow cytometer | BD | FACSCanto ![]() |
|
Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
Matrigel | Thermo | 356234 | |
mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |