Entnahme von Liquor und Blut aus der seitlichen Schwanzvene bei Ratten während EEG-Aufzeichnungen
Summary
Das Protokoll zeigt wiederholte Liquor- und Blutentnahmen von epileptischen Ratten, die parallel zur kontinuierlichen Video-Elektroenzephalogramm-Überwachung (EEG) durchgeführt werden. Diese sind von entscheidender Bedeutung, um mögliche Zusammenhänge zwischen Veränderungen verschiedener Körperflüssigkeitsmoleküle und der Anfallsaktivität zu untersuchen.
Abstract
Da die Zusammensetzung von Körperflüssigkeiten viele physiologische und pathologische Dynamiken widerspiegelt, werden in vielen experimentellen Kontexten üblicherweise biologische Flüssigkeitsproben gewonnen, um Moleküle von Interesse wie Hormone, Wachstumsfaktoren, Proteine oder kleine nicht-kodierende RNAs zu messen. Ein konkretes Beispiel ist die Probenahme biologischer Flüssigkeiten bei der Erforschung von Biomarkern für Epilepsie. In diesen Studien ist es wünschenswert, die Konzentrationen von Molekülen in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und im Plasma zu vergleichen, indem Liquor und Plasma parallel entnommen werden und der zeitliche Abstand der Probenahme von und zu den Anfällen berücksichtigt wird. Die kombinierte Liquor- und Plasmaprobenahme, gekoppelt mit Video-EEG-Monitoring bei epileptischen Tieren, ist ein vielversprechender Ansatz für die Validierung von putativen diagnostischen und prognostischen Biomarkern. Hier wird ein Verfahren der kombinierten Liquorentnahme aus der Cisterna magna und der Blutentnahme aus der lateralen Schwanzvene bei epileptischen Ratten beschrieben, die kontinuierlich per Video-EEG überwacht werden. Dieses Verfahren bietet erhebliche Vorteile gegenüber anderen häufig verwendeten Techniken. Es ermöglicht eine schnelle Probenentnahme mit minimalen Schmerzen oder Invasivität und verkürzter Anästhesiezeit. Darüber hinaus kann es verwendet werden, um Liquor- und Plasmaproben sowohl bei angebundenen als auch bei telemetrischen EEG-aufgezeichneten Ratten zu erhalten, und es kann wiederholt über mehrere Experimenttage hinweg verwendet werden. Durch die Minimierung des Stresses durch die Probenahme durch Verkürzung der Isofluran-Anästhesie sollen die Messungen die wahren Konzentrationen der untersuchten Moleküle in Bioflüssigkeiten genauer widerspiegeln. Abhängig von der Verfügbarkeit eines geeigneten analytischen Assays kann diese Technik verwendet werden, um die Konzentrationen mehrerer verschiedener Moleküle zu messen und gleichzeitig eine EEG-Aufzeichnung durchzuführen.
Introduction
Liquor cerebrospinalis (CSF) und Blutproben sind wichtig, um Biomarker für Epilepsie zu identifizieren und zu validieren, sowohl in der präklinischen als auch in der klinischen Forschung 1,2. Heutzutage konzentrieren sich die Diagnose der Epilepsie und die meisten Forschungen zu Epilepsie-Biomarkern auf EEG und Neuroimaging 3,4,5. Diese Ansätze weisen jedoch einige Einschränkungen auf. Abgesehen von routinemäßigen Kopfhautmessungen erfordert das EEG in vielen Fällen invasive Techniken wie Tiefenelektroden6. Bildgebende Verfahren des Gehirns haben eine schlechte zeitliche und räumliche Auflösung und sind relativ teuer und zeitaufwändig 7,8. Aus diesem Grund wäre die Identifizierung von nicht-invasiven, kostengünstigen und biofluidbasierten Biomarkern eine sehr attraktive Alternative. Darüber hinaus könnten diese Biofluid-Biomarker mit verfügbaren diagnostischen Ansätzen kombiniert werden, um ihre Vorhersagefähigkeit zu schärfen.
Patienten, bei denen Epilepsie diagnostiziert wurde, werden routinemäßig einem EEG 9,10 und einer Blutentnahme 11,12,13,14 unterzogen, und viele auch einer Liquorentnahme, um lebensbedrohliche Ursachen (z. B. akute Infektionen, autoimmune Enzephalitis) auszuschließen15. Diese Blut- und Liquorproben können in der klinischen Forschung verwendet werden, um Biomarker für Epilepsie zu identifizieren. Zum Beispiel haben Hogg und Mitarbeiter herausgefunden, dass ein Anstieg von drei Plasma-tRNA-Fragmenten dem Auftreten von Anfällen bei menschlicher Epilepsie vorausgeht14. In ähnlicher Weise können Interleukin-1beta (IL-1β)-Spiegel im menschlichen Liquor und Serum, ausgedrückt als Verhältnis der IL-1β-Spiegel im Liquor zum Serum, die Entwicklung einer posttraumatischen Epilepsie nach einem Schädel-Hirn-Trauma vorhersagen16. Diese Studien unterstreichen die Bedeutung der Probenahme von Bioflüssigkeiten für die Epilepsie-Biomarker-Forschung, aber sie sehen sich mit mehreren Einschränkungen konfrontiert, die klinischen Studien innewohnen, z. B. der Mitbegründungsfaktor von Antiepileptika (AEDs) im Blut, der häufige Mangel an Informationen über die Ätiologie, unzureichende Kontrollen, eine bescheidene Anzahl von Patienten und andere17,18.
Die präklinische Forschung bietet weitere Möglichkeiten, Moleküle in Bioflüssigkeiten als potenzielle Biomarker für Epilepsie zu untersuchen. Tatsächlich ist es möglich, Plasma und/oder Liquor von Tieren zu entnehmen, während EEG-Aufzeichnungen durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Probenahme wiederholt über mehrere Tage des Experiments durchgeführt werden, und eine Reihe von Kontrollen, die mit Alter, Geschlecht und epileptischen Beleidigungen übereinstimmen, können verwendet werden, um die Robustheit der Studie zu verbessern. Hier wird eine flexible Technik zur Gewinnung von Liquor aus Cisterna magna mit paralleler Entnahme von Plasma aus der Schwanzvene bei EEG-überwachten Ratten detailliert beschrieben. Die vorgestellte Technik hat mehrere Vorteile gegenüber alternativen Methoden. Durch die Verwendung eines Schmetterlingsnadelansatzes ist es möglich, Liquor mehrmals zu entnehmen, ohne die Funktion von EEG-Elektroden oder ähnlichen Kopfimplantaten zu beeinträchtigen. Dies stellt eine Verfeinerung der intrathekalen Katheterentnahmeverfahren dar, die mit einem relativ hohen Infektionsrisiko verbunden sind. Darüber hinaus ist der für die Blutentnahme verwendete Freifall-Tropfen-Ansatz anderen Ansätzen der Schwanzvenen-Blutentnahme überlegen, da das Risiko einer Hämolyse stark reduziert ist, da das Blut nicht durch Schläuche fließt und kein Vakuumdruck ausgeübt wird. Unter streng keimfreien Bedingungen durchgeführt, besteht für die Tiere ein besonders geringes Infektionsrisiko. Darüber hinaus kann durch den Beginn der Blutentnahme ganz am Ende des Schwanzes der Tiere die Entnahme mehrmals wiederholt werden. Solche Techniken sind leicht zu beherrschen und können in vielen präklinischen Studien zu Erkrankungen des zentralen Nervensystems angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorliegende Arbeit veranschaulicht eine leicht zu beherrschende Technik der Liquor- und Blutentnahme bei Ratten, die nicht nur für Studien in Modellen der Epilepsie, sondern auch für andere neurologische Zustände oder Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson oder Multiple Sklerose nützlich sein kann. In der Epilepsieforschung sind beide Probenahmeverfahren gekoppelt mit Video-EEG ideal, wenn eine Korrelation zwischen den Konzentrationen verschiedener löslicher Moleküle und der Anfallsaktivität angestrebt wird. Aus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch einen Zuschuss aus dem Horizon 2020-Arbeitsprogramm der Europäischen Union (Ausschreibung H2020-FETOPEN-2018-2020) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung 964712 (PRIME; an M. Simonato) unterstützt.
Materials
| Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
| Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
| Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
| Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
| Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
| Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
| Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
| Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
| Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
| Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
| Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
| Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
References
- Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
- Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
- Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
- Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
- van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
- Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
- Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
- Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
- Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
- Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
- Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
- Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
- Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
- Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
- Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis – diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
- Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
- Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
- Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
- Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
- Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
- Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- . Blood sampling: Rat Available from: https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022)
- Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
- Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
- Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
- Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
- Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
- Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy–comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
- van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
- Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).
