Toma de muestras de líquido cefalorraquídeo y sangre de la vena lateral de la cola en ratas durante los registros de EEG
Summary
El protocolo muestra repetidas recolecciones de líquido cefalorraquídeo y sangre de ratas epilépticas realizadas en paralelo con un monitoreo continuo de video-electroencefalograma (EEG). Estos son fundamentales para explorar posibles vínculos entre los cambios en varias moléculas de fluidos corporales y la actividad convulsiva.
Abstract
Debido a que la composición de los fluidos corporales refleja muchas dinámicas fisiológicas y patológicas, las muestras líquidas biológicas se obtienen comúnmente en muchos contextos experimentales para medir moléculas de interés, como hormonas, factores de crecimiento, proteínas o pequeños ARN no codificantes. Un ejemplo concreto es el muestreo de líquidos biológicos en la investigación de biomarcadores para la epilepsia. En estos estudios, es deseable comparar los niveles de moléculas en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y en el plasma, mediante la extracción de LCR y plasma en paralelo y considerando la distancia temporal de la muestra desde y hacia las convulsiones. La combinación de muestras de LCR y plasma, junto con la monitorización por video-EEG en animales epilépticos, es un enfoque prometedor para la validación de biomarcadores diagnósticos y pronósticos putativos. Aquí, se describe un procedimiento combinado de extracción de LCR de la cisterna magna y la toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola en ratas epilépticas que se monitorean continuamente por video-EEG. Este procedimiento ofrece ventajas significativas sobre otras técnicas comúnmente utilizadas. Permite una toma de muestras rápida con un mínimo de dolor o invasividad, y un tiempo de anestesia reducido. Además, se puede utilizar para obtener muestras de LCR y plasma en ratas ancladas y registradas en EEG por telemetría, y se puede utilizar repetidamente durante varios días de experimento. Al minimizar el estrés debido al muestreo mediante el acortamiento de la anestesia con isoflurano, se espera que las medidas reflejen con mayor precisión los niveles reales de las moléculas investigadas en los biofluidos. Dependiendo de la disponibilidad de un ensayo analítico adecuado, esta técnica se puede utilizar para medir los niveles de múltiples moléculas diferentes mientras se realiza el registro de EEG al mismo tiempo.
Introduction
La toma de muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) y sangre son importantes para identificar y validar biomarcadores de epilepsia, tanto en la investigación preclínica como en la clínica 1,2. Hoy en día, el diagnóstico de la epilepsia y la mayor parte de la investigación sobre biomarcadores de epilepsia se centra en el EEG y la neuroimagen 3,4,5. Estos enfoques, sin embargo, presentan varias limitaciones. Además de las mediciones rutinarias del cuero cabelludo, en muchos casos, el EEG requiere técnicas invasivas como electrodos de profundidad6. Los métodos de imagen cerebral tienen poca resolución temporal y espacial y son relativamente caros y requieren mucho tiempo 7,8. Por esta razón, la identificación de biomarcadores no invasivos, de bajo costo y basados en biofluidos proporcionaría una alternativa muy atractiva. Además, estos biomarcadores de biofluidos podrían combinarse con los enfoques diagnósticos disponibles para mejorar su capacidad de predicción.
Los pacientes diagnosticados de epilepsia son sometidos rutinariamente a EEG 9,10 y muestras de sangre 11,12,13,14, y muchos también a la retirada del LCR para excluir causas potencialmente mortales (i.e., infecciones agudas, encefalitis autoinmune)15. Estas muestras de sangre y LCR se pueden utilizar en investigaciones clínicas con el objetivo de identificar biomarcadores de epilepsia. Por ejemplo, Hogg y sus colaboradores han encontrado que un aumento en tres fragmentos plasmáticos de ARNt precede a la aparición de convulsionesen la epilepsia humana. Del mismo modo, los niveles de interleucina-1beta (IL-1β) en el LCR y el suero humanos, expresados como proporción de los niveles de IL-1β en el LCR sobre el suero, pueden predecir el desarrollo de epilepsia postraumática después de una lesión cerebral traumática16. Estos estudios destacan la importancia del muestreo de biofluidos para la investigación de biomarcadores de epilepsia, pero enfrentan múltiples limitaciones intrínsecas a los ensayos clínicos, por ejemplo, el factor cofundador de los fármacos antiepilépticos (FAE) en sangre, la frecuente falta de información etiológica, los controles inadecuados, el número modesto de pacientes y otros17,18.
La investigación preclínica ofrece otras oportunidades para investigar moléculas en biofluidos como posibles biomarcadores de epilepsia. De hecho, es posible extraer plasma y/o LCR de animales mientras se realizan registros de EEG. Además, el muestreo se puede realizar repetidamente a lo largo de varios días del experimento, y se puede utilizar una serie de controles emparejados por edad, sexo y agresiones epilépticas para mejorar la solidez del estudio. Aquí, se describe en detalle una técnica flexible para obtener LCR de cisterna magna con extracción paralela de plasma de la vena de la cola en ratas monitoreadas por EEG. La técnica presentada tiene varias ventajas sobre los métodos alternativos. Mediante el uso de un enfoque de aguja de mariposa, es posible recolectar LCR varias veces sin comprometer la función de los electrodos de EEG o implantes de cabeza similares. Esto representa un refinamiento de los procedimientos de retirada del catéter intratecal, que se asocian con un riesgo relativamente alto de infección. Además, el enfoque de caída libre utilizado para la extracción de sangre es superior a otros enfoques de extracción de sangre en la vena de cola debido al riesgo altamente reducido de hemólisis, debido al hecho de que la sangre no pasa a través de tubos y no se aplica presión de vacío. Si se realiza en condiciones estrictas libres de gérmenes, existe un riesgo particularmente bajo de infección para los animales. Además, al iniciar las extracciones de sangre al final de la cola de los animales, el muestreo se puede repetir varias veces. Estas técnicas son fáciles de dominar y se pueden aplicar en muchos estudios preclínicos de trastornos del sistema nervioso central.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente trabajo ilustra una técnica fácil de dominar de la recolección de LCR y sangre en ratas, que puede ser útil no solo para estudios en modelos de epilepsia, sino también de otras afecciones o enfermedades neurológicas como el Alzheimer, el Parkinson o la esclerosis múltiple. En la investigación de la epilepsia, ambos procedimientos de muestreo junto con el video-EEG son ideales cuando se busca una correlación entre los niveles de diferentes moléculas solubles y la actividad convulsiva. Por esta razón…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio contó con el apoyo de una subvención del Programa de Trabajo Horizonte 2020 de la Unión Europea (convocatoria H2020-FETOPEN-2018-2020) en virtud del acuerdo de subvención 964712 (PRIME; a M. Simonato).
Materials
| Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
| Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
| Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
| Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
| Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
| Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
| Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
| Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
| Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
| Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
| Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
| Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
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