방법 논문

섬유아세포 활성화를 연구하기 위한 3D 바이오프린팅 광조정 가능 하이드로겔

DOI:

10.3791/65639

⸱

2023년 6월 30일

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Colorado Denver | Anschutz Medical Campus, 2Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

광조정 가능한 하이드로겔은 빛 노출에 반응하여 공간적, 시간적으로 변형될 수 있습니다. 이러한 유형의 생체 재료를 세포 배양 플랫폼에 통합하고 미세환경 강성 증가와 같은 변화를 동적으로 유발함으로써 연구자들은 섬유화 질환 진행 중에 발생하는 세포외 기질(ECM)의 변화를 모델링할 수 있습니다. 여기에서, 젤라틴 지지 수조 내에서 2개의 순차적 중합 반응이 가능한 광조정 가능한 하이드로겔 생체 재료를 3D 바이오프린팅하기 위한 방법이 제시된다. 부유 하이드로겔의 자유형 가역적 임베딩(FRESH) 바이오프린팅 기술은 마이클 첨가 반응을 촉진하기 위해 지지 수조의 pH를 조정하여 조정되었습니다. 먼저, 폴리(에틸렌글리콜)-알파메타크릴레이트(PEGαMA)를 함유하는 바이오잉크를 세포분해성 가교제와 화학량론적으로 반응시켜 연질 하이드로겔을 형성하였다. 이 연질 하이드로겔은 나중에 광자극제와 빛에 노출되어 미반응기의 동질중합을 유도하고 하이드로겔을 경화시켰습니다. 이 프로토콜은 하이드로겔 합성, 3D 바이오프린팅, 광보강 및 3D 구조 내에서 섬유아세포 활성화를 평가하기 위한 종말점 특성 분석을 다룹니다. 여기에 제시된 방법을 통해 연구자들은 pH 촉매 중합 반응을 겪는 다양한 물질을 3D 바이오프린팅할 수 있으며 조직 항상성, 질병 및 복구의 다양한 모델을 엔지니어링하는 데 구현할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D 바이오프린팅은 연구자들이 3D 부피 내에 세포와 생체 재료를 정밀하게 증착하고 생체 조직의 복잡한 계층 구조를 재현할 수 있도록 하는 혁신적인 기술입니다. 지난 10년 동안 3D 바이오프린팅의 발전으로 박동하는 인간 심장 조직1, 신장 조직의 기능적 모델2, 폐 내 가스 교환 모델3, 암 연구를 위한 종양 모델4이 개발되었다. FRESH(Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel) 바이오프린팅과 같은 임베디드 3D 바이오프린팅 기술의 발명으로 폐 혈관(pulmonary blood vessel)5 및 심지어 인간의 심장( human heart)6 과 같은 복잡한 연조직 구조를 3D로 재현할 수 있게 되었습니다. FRESH 3D 바이오프린팅은 전단 담화 지지 수조로의 압출을 통해 부드러운 바이오잉크와 저점도 바이오잉크의 층별 프린팅을 용이하게 합니다. 서포트 수조는 Bingham 플라스틱 역할을 하고 인쇄 후 바이오잉크의 의도된 모양과 구조를 유지하는 밀접하게 포장된 젤라틴 미세 입자와 ....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. PEGαMA 합성 및 특성화

참고 : 폴리 (에틸렌 글리콜) - 알파 메타 크릴 레이트 (PEGαMA) 합성은 Hewawasam et al .에서 채택되었으며 습기가없는 조건에서 수행되었습니다9.

  1. 반응물의 무게를 잰다.
    알림: 예를 들어ample, 5g 10kg/mol 8암 PEG-하이드록실(PEG-OH) 및 0.38g 수소화나트륨(NaH)의 무게를 잰다( 재료 표 참조).
  2. 250mL 슐렝크 플라스크에 교반 막대를 넣고 아르곤으로 퍼지합니다.
  3. 슐렝크 플라스크 내에서 용해하는 데 필요한 가장 적은 양의 무수 테트라히드로푸란(THF)에 PEG-OH를 용해시킵니다.
    참고: 약 80mL의 THF는 5g의 PEG-OH를 용해시킵니다. PEG-OH를 용해하는 데 필요한 최소량의 THF를 추가합니다.
  4. 반응 혼합물에 몰 초과 NaH의 3배를 첨가하고 실온(RT)에서 30분 동안 교반합니다.
  5. 과잉 몰 에틸 2-(브로모메틸)아크릴레이트(EBrMA, 재료표 참조)를 슐렝크 플라스크에 6배 적가하고 반응 용기를 ....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 인체 조직을 모방한 형상에서 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 동적 및 시간적 경화가 가능한 구조를 만들기 위해 지지 수조 내에서 광조정 가능한 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다. 먼저, 이 프로토콜은 이 광조정 가능 폴리머 시스템의 중추인 PEGαMA를 합성하는 방법을 설명했습니다. 핵 자기 공명(NMR) 분광법 측정은 96.5%에서 성공적인 PEGαMA 기능화를 보여주었습니다(그림 1). 이 절차에는 90% 이상의 기능화 값을 사용할 수 있습니다. 다음으로 폐 혈관을 모방하기 위해 중공 실린더의 3D CAD 모델을 만드는 방법에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 다운로드 가능한 3D CAD 모델은 보충 파일 1에서 제공 되며, 이 설계에 대한 관련 G 코드는 보충 파일 2에서 사용할 수 있습니다. 이 CAD 모델은 높이 4mm, 내경 4mm, 벽 두께 300μm 치수의 구조를 생성했습.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제어된 빛 노출에 대한 반응으로 2단계 중합 반응은 공간적 및 시간적 제어를 통해 생체 재료를 강화할 수 있습니다. 여러 연구에서 이 기술을 활용하여 다양한 플랫폼 5,8,9,10,11,21,22,23에서 세포-매트릭스 상호작용을 평가했습니다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 포토마스크 또는 이광자 여기 방법을 사용하여 3D 바이오프린팅 구조의 개별 절편을 강화하고 이전 간행물 5,8

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다. 이 원고의 일부는 IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf 의 © 허가를 받아 복제되었습니다. 5 판권 소유.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 Adam Feinberg 박사(카네기 멜론 대학교)와 3D 바이오프린팅 오픈 소스 워크숍을 주최한 사람들에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 사람들은 FRESH 바이오프린팅 기술을 배우고 이러한 연구에 사용되는 3D 바이오프린터를 구축할 수 있었습니다. 덧붙여, 저자들은 이 원고에서 인물을 생산하는 데 사용된 Biorender.com 인정하고 싶다. 이 연구는 Rose Community Foundation(DDH 및 CMM), Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award(DDH 및 CMM), Award 1941401(CMM)의 National Science Foundation, Award W81XWH-20-1-0037(CMM)의 미 육군부, Award R21 CA252172(CMM)의 NIH 국립 암 연구소, University of Colorado Anschutz Medical Campus의 Ludeman Family Center for Women's Health Research(DDH 및 CMM), R01 HL080396(CMM), R01 HL153096(CMM), F31 HL151122(DDH) 및 T32 HL072738(DDH 및 AT).

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AccuMax 라디오미터/광도계 키트Spectronics CorporationXPR-3000광도를 측정하기 위해, 아세트산을 광경화하는 데 사용됩니다
 PEGaMA 합성 중 사용되는Fisher ScientificBP2401-500
AcetoneFisher ScientificA184극저온 절편과 함께 사용
ActinGreen 488 ReadyProbesFisher ScientificR37110염색에 사용
ReynoldsF28028
무수 테트라하이드로푸란(THF)Sigma-Aldrich401757-1L사용 PEGaMA 합성 중
아르곤 압축 가스에어가스AR R300PEGaMA 합성 중 사용
8 Arm 폴리(에틸렌 글리콜)-하이드록실(PEG-OH)JenKem Technology8ARM-PEG-10KPEGaMA 합성 중 사용
365 nm 대역통과 필터Edmund Optics65-191광사진 촬영에 사용
소 혈청 알부민(BSA)Fisher ScientificBP9700-100염색 공정 중 사용
Buchner FunnelQuark GlassQFN-8-14PEGaMA 합성 중 사용
Calcein AMInvitrogen65-0853-39염색 공정 중 사용
Celite 545 (여과 보조제)EMD MilliporeCX0574-1PEGaMA 합성 중 사용
하전 현미경 슬라이드Globe Scientific1358W
클로로포름-dSigma-Aldrich151823-10X0.75MLPEGaMA
Click-iT Plus EdU 세포 증식 키트특성에 사용 InvitrogenC10637
50 mL 원뿔형 튜브CELLTREAT667050B
극저온 안전 키트Cole-ParmerEW-25000-85
저온 유지 장치LeicaCM 1850-3-1
투석 튜빙Repligen132105
4',6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MG염색에 사용
Diethyl EtherFisher ScientificE1384PEGaMA 합성 중 사용
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich10197777001Bioink 구성 요소
, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)CytivaSH30271. FS
Filter PaperWhatman1001-090PEGaMA synthesis 사용
Freezone 2.5L Freeze Dry SystemLabconcoLA-2.5LRLyophilizer
Fusion 360AutodeskN/A소프트웨어 다운로드
2.5 mL 기밀 주사기Hamilton81420바이오프린팅에 사용
15 게이지 1.5" IT 시리즈 팁Jensen GlobalJG15-1.5X바이오프린팅에 사용
30 게이지 0.5" HP 시리즈 팁Jensen GlobalJG30-0.5HPX바이오프린팅에 사용
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 항체Fisher ScientificA21422염색에 사용
Fisher ScientificC2H5NO2염색 과정에서 사용
혈구계Fisher Scientific1461
HoechstThermo Scientific62249염색 과정에서 사용
Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs)AcceGenABC-TC3773 2세 남자 환자로부터
염산 (HCl)Fisher ScientificA144-500pH 조정 용액에 사용
ImageJNational Institutes of Health (NIH)N/A무료 소프트웨어 다운로드
ImmEdge® PenVector LaboratoriesH-4000염색 공정 중 사용
인큐베이터VWRVWR51014991
생명 유지 젤라틴 미립자 슬러리 (젤라틴 슬러리)Advanced Biomatrix5244-10GM바이오프린팅
광학 현미경OlympusCKX53도립광 현미경
리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트( LAP)Sigma-Aldrich900889-5G광초기
사용 광스티프닝 액체 질소N/A/A
LulzBot Mini 2 LulzBotN/A바이오프린터는
Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B 에 적합했습니다.폴리사이언스 Inc.669775-30-8
2-메틸부탄시그마-알드리치M32631-4L
마이크로맨 모세관 피스톤 CP1000VWR76178-166용적변위 피펫 팁
MMP2 분해성 교차결합제(KCGGPQGIWGQGCK)GL BiochemN/ABioink 구성 요소
마우스 Anti-Human αSMA 단클론 항체Fisher ScientificMA5-11547염색에 사용
OmniCure 시리즈 2000  광에 사용되는 LumenS2000-XLA
 전자 현미경 과학15710샘플을 고정하는 데 사용되는
pH 미터Mettler Toledo FP20 
pH 스트립Cytiva10362010
인산염 완충 식염수(PBS)Hyclone Laboratories, Inc.싸이티바 SH30256. FS
피펫 세트Fisher Scientific14-388-100
10 &마이크로; L 피펫 팁USA Scientific1120-3710
20 &마이크로; L 피펫 팁USA Scientific1183-1510
200 µ L 피펫 팁USA Scientific1111-0700
1000 &마이크로; L 피펫 팁USA Scientific1111-2721
폴리(에틸렌 글리콜)-알파 메타크릴레이트(PEG&알파; MA)N/AN/A합성 단계에 대한 원고 참조
Poly(Ethylene Oxide) (PEO)Sigma-Aldrich372773-250GBioink component
Positive DisplacementPipette Fisher ScientificFD10004G100-1000 µ L
수산화칼륨 (KOH)Sigma-Aldrich221473-500GpH 조정에 사용
ProLong Gold Antifade ReagentInvitrogenP36930염색 공정 중 사용
PronterfaceAll3DPN/A소프트웨어 다운로드
Propidium IodideSigma-AldrichP4864-10MLRGD
펩타이드(CGRGDS)GL BiochemN/ABioink 구성 요소
록커VWR10127-876
회전 증발기 Thomas Scientific11100V2022PEGaMA 합성
시 사용 고무 밴드스테이
Schlenk Flask Kemtech AmericaF902450PEGaMA 합성 중에 사용됩니다
Slic3rSlic3rN/A소프트웨어 다운로드
Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKitLonzaCC-3182키트에는 CC-3181 및 CC-4149 구성 요소가 포함되어
Sodium Hydride PEGaMA 합성 중 사용되는Sigma-Aldrich223441-50G
Sorvall ST 40R 원심분리기Fisher Scientific75-004-525
Stir BarVWR58948-091
주사기 필터VWR28145-483필터 용액
T-75 Tissue-Culture Treated FlaskVWR82050-856세포 배양 작업에 사용
Tissue-Tek CyromoldSakura4557
Tissue-Tek OCT 컴파운드 (OCT)Sakura4583
Tris(2-Carboxyethyl) 포스핀(TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Triton X-100Fisher BioreagentsC34H622O11염색 공정 중 사용
Trypan BlueSigma-AldrichT8154-20ML세포 배양에 사용 작업
0.05% Trypsin-EDTAGibco25-300-062세포 배양 작업에 사용
Tween 20Fisher BioreagentsC58H114O26염색 공정 중 사용
정립 현미경 OlympusBX63F형광 현미경 기능
수조PolyScienceWBE20A11B
24-Well 조직 배양 플레이트Corning3527
알루미늄 호일 염색에 사용 제 N스티프닝 파라포름알데히드(PFA)Dynamics UV 광원 염색에 사용플 808659 . 있습니다. 년

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217(2022).
  2. Lin, N. Y. C., et al.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

관련 논문