이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
광조정 가능한 하이드로겔은 빛 노출에 반응하여 공간적, 시간적으로 변형될 수 있습니다. 이러한 유형의 생체 재료를 세포 배양 플랫폼에 통합하고 미세환경 강성 증가와 같은 변화를 동적으로 유발함으로써 연구자들은 섬유화 질환 진행 중에 발생하는 세포외 기질(ECM)의 변화를 모델링할 수 있습니다. 여기에서, 젤라틴 지지 수조 내에서 2개의 순차적 중합 반응이 가능한 광조정 가능한 하이드로겔 생체 재료를 3D 바이오프린팅하기 위한 방법이 제시된다. 부유 하이드로겔의 자유형 가역적 임베딩(FRESH) 바이오프린팅 기술은 마이클 첨가 반응을 촉진하기 위해 지지 수조의 pH를 조정하여 조정되었습니다. 먼저, 폴리(에틸렌글리콜)-알파메타크릴레이트(PEGαMA)를 함유하는 바이오잉크를 세포분해성 가교제와 화학량론적으로 반응시켜 연질 하이드로겔을 형성하였다. 이 연질 하이드로겔은 나중에 광자극제와 빛에 노출되어 미반응기의 동질중합을 유도하고 하이드로겔을 경화시켰습니다. 이 프로토콜은 하이드로겔 합성, 3D 바이오프린팅, 광보강 및 3D 구조 내에서 섬유아세포 활성화를 평가하기 위한 종말점 특성 분석을 다룹니다. 여기에 제시된 방법을 통해 연구자들은 pH 촉매 중합 반응을 겪는 다양한 물질을 3D 바이오프린팅할 수 있으며 조직 항상성, 질병 및 복구의 다양한 모델을 엔지니어링하는 데 구현할 수 있습니다.
서론
3D 바이오프린팅은 연구자들이 3D 부피 내에 세포와 생체 재료를 정밀하게 증착하고 생체 조직의 복잡한 계층 구조를 재현할 수 있도록 하는 혁신적인 기술입니다. 지난 10년 동안 3D 바이오프린팅의 발전으로 박동하는 인간 심장 조직1, 신장 조직의 기능적 모델2, 폐 내 가스 교환 모델3, 암 연구를 위한 종양 모델4이 개발되었다. FRESH(Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel) 바이오프린팅과 같은 임베디드 3D 바이오프린팅 기술의 발명으로 폐 혈관(pulmonary blood vessel)5 및 심지어 인간의 심장( human heart)6 과 같은 복잡한 연조직 구조를 3D로 재현할 수 있게 되었습니다. FRESH 3D 바이오프린팅은 전단 담화 지지 수조로의 압출을 통해 부드러운 바이오잉크와 저점도 바이오잉크의 층별 프린팅을 용이하게 합니다. 서포트 수조는 Bingham 플라스틱 역할을 하고 인쇄 후 바이오잉크의 의도된 모양과 구조를 유지하는 밀접하게 포장된 젤라틴 미세 입자와 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. PEGαMA 합성 및 특성화
참고 : 폴리 (에틸렌 글리콜) - 알파 메타 크릴 레이트 (PEGαMA) 합성은 Hewawasam et al .에서 채택되었으며 습기가없는 조건에서 수행되었습니다9.
- 반응물의 무게를 잰다.
알림: 예를 들어ample, 5g 10kg/mol 8암 PEG-하이드록실(PEG-OH) 및 0.38g 수소화나트륨(NaH)의 무게를 잰다( 재료 표 참조). - 250mL 슐렝크 플라스크에 교반 막대를 넣고 아르곤으로 퍼지합니다.
- 슐렝크 플라스크 내에서 용해하는 데 필요한 가장 적은 양의 무수 테트라히드로푸란(THF)에 PEG-OH를 용해시킵니다.
참고: 약 80mL의 THF는 5g의 PEG-OH를 용해시킵니다. PEG-OH를 용해하는 데 필요한 최소량의 THF를 추가합니다. - 반응 혼합물에 몰 초과 NaH의 3배를 첨가하고 실온(RT)에서 30분 동안 교반합니다.
- 과잉 몰 에틸 2-(브로모메틸)아크릴레이트(EBrMA, 재료표 참조)를 슐렝크 플라스크에 6배 적가하고 반응 용기를 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 프로토콜은 인체 조직을 모방한 형상에서 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 동적 및 시간적 경화가 가능한 구조를 만들기 위해 지지 수조 내에서 광조정 가능한 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다. 먼저, 이 프로토콜은 이 광조정 가능 폴리머 시스템의 중추인 PEGαMA를 합성하는 방법을 설명했습니다. 핵 자기 공명(NMR) 분광법 측정은 96.5%에서 성공적인 PEGαMA 기능화를 보여주었습니다(그림 1). 이 절차에는 90% 이상의 기능화 값을 사용할 수 있습니다. 다음으로 폐 혈관을 모방하기 위해 중공 실린더의 3D CAD 모델을 만드는 방법에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 다운로드 가능한 3D CAD 모델은 보충 파일 1에서 제공 되며, 이 설계에 대한 관련 G 코드는 보충 파일 2에서 사용할 수 있습니다. 이 CAD 모델은 높이 4mm, 내경 4mm, 벽 두께 300μm 치수의 구조를 생성했습.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
제어된 빛 노출에 대한 반응으로 2단계 중합 반응은 공간적 및 시간적 제어를 통해 생체 재료를 강화할 수 있습니다. 여러 연구에서 이 기술을 활용하여 다양한 플랫폼 5,8,9,10,11,21,22,23에서 세포-매트릭스 상호작용을 평가했습니다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 포토마스크 또는 이광자 여기 방법을 사용하여 3D 바이오프린팅 구조의 개별 절편을 강화하고 이전 간행물 5,8
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다. 이 원고의 일부는 IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf 의 © 허가를 받아 복제되었습니다. 5 판권 소유.
감사의 글
저자는 Adam Feinberg 박사(카네기 멜론 대학교)와 3D 바이오프린팅 오픈 소스 워크숍을 주최한 사람들에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 사람들은 FRESH 바이오프린팅 기술을 배우고 이러한 연구에 사용되는 3D 바이오프린터를 구축할 수 있었습니다. 덧붙여, 저자들은 이 원고에서 인물을 생산하는 데 사용된 Biorender.com 인정하고 싶다. 이 연구는 Rose Community Foundation(DDH 및 CMM), Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award(DDH 및 CMM), Award 1941401(CMM)의 National Science Foundation, Award W81XWH-20-1-0037(CMM)의 미 육군부, Award R21 CA252172(CMM)의 NIH 국립 암 연구소, University of Colorado Anschutz Medical Campus의 Ludeman Family Center for Women's Health Research(DDH 및 CMM), R01 HL080396(CMM), R01 HL153096(CMM), F31 HL151122(DDH) 및 T32 HL072738(DDH 및 AT).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AccuMax 라디오미터/광도계 키트 | Spectronics Corporation | XPR-3000 | 광도를 측정하기 위해, 아세트산을 광경화하는 데 사용됩니다 |
| PEGaMA 합성 중 사용되는 | Fisher Scientific | BP2401-500 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | 극저온 절편과 함께 사용 |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | 염색에 사용 |
| Reynolds | F28028 | ||
| 무수 테트라하이드로푸란(THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | 사용 PEGaMA 합성 중 |
| 아르곤 압축 가스 | 에어가스 | AR R300 | PEGaMA 합성 중 사용 |
| 8 Arm 폴리(에틸렌 글리콜)-하이드록실(PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | PEGaMA 합성 중 사용 |
| 365 nm 대역통과 필터 | Edmund Optics | 65-191 | 광사진 촬영에 사용 |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | 염색 공정 중 사용 |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | PEGaMA 합성 중 사용 |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | 염색 공정 중 사용 |
| Celite 545 (여과 보조제) | EMD Millipore | CX0574-1 | PEGaMA 합성 중 사용 |
| 하전 현미경 슬라이드 | Globe Scientific | 1358W | |
| 클로로포름-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU 세포 증식 키트 | 특성에 사용 Invitrogen | C10637 | |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | CELLTREAT | 667050B | |
| 극저온 안전 키트 | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| 저온 유지 장치 | Leica | CM 1850-3-1 | |
| 투석 튜빙 | Repligen | 132105 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 염색에 사용 |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | PEGaMA 합성 중 사용 |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink 구성 요소 |
| , Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271. FS | |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | PEGaMA synthesis 사용 |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | 소프트웨어 다운로드 |
| 2.5 mL 기밀 주사기 | Hamilton | 81420 | 바이오프린팅에 사용 |
| 15 게이지 1.5" IT 시리즈 팁 | Jensen Global | JG15-1.5X | 바이오프린팅에 사용 |
| 30 게이지 0.5" HP 시리즈 팁 | Jensen Global | JG30-0.5HPX | 바이오프린팅에 사용 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 항체 | Fisher Scientific | A21422 | 염색에 사용 |
| Fisher Scientific | C2H5NO2 | 염색 과정에서 사용 | |
| 혈구계 | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | 염색 과정에서 사용 |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | 2세 남자 환자로부터 |
| 염산 (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | pH 조정 용액에 사용 |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | 무료 소프트웨어 다운로드 |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | 염색 공정 중 사용 |
| 인큐베이터 | VWR | VWR51014991 | |
| 생명 유지 젤라틴 미립자 슬러리 (젤라틴 슬러리) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | 바이오프린팅 |
| 광학 현미경 | Olympus | CKX53 | 도립광 현미경 |
| 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트( LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | 광초기 |
| 사용 광스티프닝 액체 질소 | N/A | /A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | 바이오프린터는 |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B 에 적합했습니다. | 폴리사이언스 Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-메틸부탄 | 시그마-알드리치 | M32631-4L | |
| 마이크로맨 모세관 피스톤 CP1000 | VWR | 76178-166 | 용적변위 피펫 팁 |
| MMP2 분해성 교차결합제(KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink 구성 요소 |
| 마우스 Anti-Human αSMA 단클론 항체 | Fisher Scientific | MA5-11547 | 염색에 사용 |
| OmniCure 시리즈 2000 | 광 | 에 사용되는 Lumen | S2000-XLA |
| 전자 현미경 과학 | 15710 | 샘플을 고정하는 데 사용되는 | |
| pH 미터 | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH 스트립 | Cytiva | 10362010 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | 싸이티바 SH30256. FS | |
| 피펫 세트 | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 &마이크로; L 피펫 팁 | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 &마이크로; L 피펫 팁 | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µ L 피펫 팁 | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 &마이크로; L 피펫 팁 | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 폴리(에틸렌 글리콜)-알파 메타크릴레이트(PEG&알파; MA) | N/A | N/A | 합성 단계에 대한 원고 참조 |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement | Pipette Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µ L |
| 수산화칼륨 (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | pH 조정에 사용 |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | 염색 공정 중 사용 |
| Pronterface | All3DP | N/A | 소프트웨어 다운로드 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | RGD |
| 펩타이드(CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink 구성 요소 |
| 록커 | VWR | 10127-876 | |
| 회전 증발기 | Thomas Scientific | 11100V2022 | PEGaMA 합성 |
| 시 사용 고무 밴드 | 스테이 | ||
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | PEGaMA 합성 중에 사용됩니다 |
| Slic3r | Slic3r | N/A | 소프트웨어 다운로드 |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | 키트에는 CC-3181 및 CC-4149 구성 요소가 포함되어 |
| Sodium Hydride | PEGaMA 합성 중 사용되는 | Sigma-Aldrich | 223441-50G |
| Sorvall ST 40R 원심분리기 | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| 주사기 필터 | VWR | 28145-483 | 필터 용액 |
| T-75 Tissue-Culture Treated Flask | VWR | 82050-856 | 세포 배양 작업에 사용 |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek OCT 컴파운드 (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) 포스핀(TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | 염색 공정 중 사용 |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | 세포 배양에 사용 작업 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | 세포 배양 작업에 사용 |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | 염색 공정 중 사용 |
| 정립 현미경 Olympus | BX63F | 형광 현미경 기능 | |
| 수조 | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well 조직 배양 플레이트 | Corning | 3527 |
참고문헌
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217(2022).
- Lin, N. Y. C., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
