3D bioprinting fototunable hydrogeler for å studere fibroblastaktivering
Summary
Denne artikkelen beskriver hvordan du 3D bioprint fototunable hydrogeler for å studere ekstracellulær matriksavstivning og fibroblastaktivering.
Abstract
Fototunable hydrogeler kan transformere romlig og tidsmessig som respons på lyseksponering. Inkorporering av disse typer biomaterialer i cellekulturplattformer og dynamisk utløsende endringer, for eksempel økende mikromiljøstivhet, gjør det mulig for forskere å modellere endringer i den ekstracellulære matrisen (ECM) som oppstår under fibrotisk sykdomsprogresjon. Her presenteres en metode for 3D-bioprinting av et fototunable hydrogelbiomateriale som er i stand til to sekvensielle polymerisasjonsreaksjoner i et gelatinstøttebad. Teknikken med Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting ble tilpasset ved å justere pH i støttebadet for å lette en Michael-addisjonsreaksjon. Først ble bioblekket som inneholdt poly (etylenglykol) -alfametakrylat (PEGαMA) reagert off-støkiometri med en cellenedbrytbar tverrbinder for å danne myke hydrogeler. Disse myke hydrogelene ble senere utsatt for fotoinitator og lys for å indusere homopolymerisering av uomsatte grupper og stive hydrogelen. Denne protokollen dekker hydrogelsyntese, 3D-bioprinting, fotostivering og endepunktkarakteriseringer for å vurdere fibroblastaktivering i 3D-strukturer. Metoden som presenteres her gjør det mulig for forskere å 3D-bioprinte en rekke materialer som gjennomgår pH-katalyserte polymerisasjonsreaksjoner og kan implementeres for å konstruere ulike modeller av vevshomeostase, sykdom og reparasjon.
Introduction
3D-bioprinting er en transformativ teknologi som gjør det mulig for forskere å nøyaktig deponere celler og biomaterialer i 3D-volumer og gjenskape den komplekse hierarkiske strukturen til biologiske vev. I løpet av det siste tiåret har fremskritt innen 3D-bioprinting skapt bankende humant hjertevev1, funksjonelle modeller av nyrevev2, modeller av gassutveksling i lunge3 og tumormodeller for kreftforskning4. Oppfinnelsen av innebygde 3D-bioprintingsteknikker, for eksempel Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH) bioprinting, har gjort det mulig å reprodusere komplekse bløtvevstrukturer som lungeblodkar5 og til og med menneskehjerte6 i 3D. FRESH 3D-bioprinting muliggjør lag-for-lag-utskrift av myke bioblekk med lav viskositet gjennom ekstrudering i et støttebad for skjærtynning. Støttebadet består av et materiale som tettpakkede gelatinmikropartikler som fungerer som en Bingham-plast og opprettholder den tiltenkte formen og strukturen til bioblekket etter utskrift. Når den trykte konstruksjonen har størknet, kan støttebadet løses opp ved å øke temperaturen til 37 °C7.
En nylig oversiktsartikkel oppsummerte materialene som har blitt 3D-bioprintet i ulike publikasjoner ved hjelp av FRESH-teknikk. Disse naturlig avledede materialene spenner fra kollagen type I til metakrylert hyaluronsyre og representerer flere forskjellige geleringsmekanismer7. De fleste forskningsstudier utført ved hjelp av denne 3D-bioprintingsteknikken bruker statiske biomaterialer som ikke endres som respons på ytre stimuli. Dynamiske fototunable hydrogel biomaterialer har blitt brukt av vårt laboratorium og andre 8,9,10,11,12 for å modellere en rekke fibrotiske sykdommer. I motsetning til statiske biomaterialer tillater fototunable bioinks at en myknet modell med lavere elastisk modulverdi opprettes og senere stivnes for å utforske cellulære responser på økning i mikromiljøavstivning.
Fibrotiske sykdommer er preget av en økning i den ekstracellulære matriksproduksjonen som kan forårsake arrdannelse og stivning13. Vevsavstivning kan initiere ytterligere skade og ødeleggelse av det berørte vevet, forårsaker permanent organskade og til og med død; Fibrotiske lidelser er ansvarlig for en tredjedel av dødeligheten over hele verden. Fibroblaster produserer overflødig og avvikende ekstracellulær matrise i denne sykdomstilstanden14,15. Økt fibroblastproliferasjon og ekstracellulær matriksavsetning stiver vevet ytterligere og aktiverer en profibrotisk positiv tilbakemeldingssløyfe16,17,18,19. Å studere fibroblastaktivering er viktig for å forstå fibrotiske sykdommer. Her presenterer vi human pulmonal arteriell hypertensjon (PAH) som et eksempel på en fibrotisk lidelse der det er viktig å etterligne 3D-geometrien til blodkaret ved hjelp av 3D-bioprinting og introdusere de dynamiske avstivningsegenskapene til fototjusterbare hydrogeler. PAH er en tilstand der trykket i de viktigste lungearteriene overgår normale nivåer og påfører belastning på hjertet, øker human pulmonal arterie adventitial fibroblast (HPAAF) aktivering og stiver blodkarvevet16,17,18,19. En fototunable poly (etylenglykol)-alfametakrylat (PEGαMA) bioblekkformulering muliggjør tidsmessig stivning i konstruksjoner og hjelper til med å modellere både sunt vev og sykdomsprogresjon 5,8,9,10. Utnyttelse av denne unike egenskapen muliggjør kvantifisering av HPAAF-aktivering og spredning som respons på mikromiljøavstivning i 3D, og kan gi verdifull innsikt i de cellulære mekanismene som er involvert i denne sykdommen. Protokollen beskrevet her vil tillate forskere å lage 3D-modeller som rekapitulerer endringer i det ekstracellulære mikromiljøet under sykdomsprogresjon eller vevsreparasjon og studerer fibroblastaktivering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Totrinns polymerisasjonsreaksjoner som respons på kontrollert lyseksponering kan stive biomaterialer med romlig og tidsmessig kontroll. Flere studier har utnyttet denne teknikken for å evaluere cellematriseinteraksjoner i forskjellige plattformer 5,8,9,10,11,21,22,23.<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) og de som var vertskap for 3D Bioprinting Open-Source Workshop. Disse personene gjorde det mulig å lære teknikkene for FRESH bioprinting og bygge 3D-bioprinteren som ble brukt til disse studiene. I tillegg ønsker forfatterne å anerkjenne Biorender.com, som ble brukt til å produsere figurer i dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av flere grupper eller finansieringskilder, inkludert Rose Community Foundation (DDH og CMM), en Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH og CMM), National Science Foundation under Award 1941401 (CMM), Department of the Army under Award W81XWH-20-1-0037 (CMM), National Cancer Institute of NIH under Award R21 CA252172 (CMM), Ludeman Family Center for Women’s Health Research ved University of Colorado Anschutz Medical Campus (DDH og CMM), National Heart, Lung and Blood Institute of National Institutes of Health under Awards R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) og T32 HL072738 (DDH og AT).
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
References
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
- Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
- Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
- Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
- Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
- Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
- Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904 (2021).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
- Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792 (2012).
- Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2 (2014).
- Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
- Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
- Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
- Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387 (2016).
- Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
- Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H. Mechanosensing and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 74-84 (2018).
- Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
- Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
- Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
- Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
- Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758 (2023).
- Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871 (2023).
- Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550 (2023).
- Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047 (2022).
