3D-bioprintning av fotoavstämbara hydrogeler för att studera fibroblastaktivering
Summary
Den här artikeln beskriver hur man 3D-bioprintar fototunable hydrogeler för att studera extracellulär matrisförstyvning och fibroblastaktivering.
Abstract
Fototunable hydrogeler kan omvandlas rumsligt och tidsmässigt som svar på ljusexponering. Genom att inkorporera dessa typer av biomaterial i cellodlingsplattformar och dynamiskt utlösa förändringar, såsom ökad mikromiljöstyvhet, kan forskare modellera förändringar i den extracellulära matrisen (ECM) som uppstår under fibrotisk sjukdomsprogression. Här presenteras en metod för 3D-bioprintning av ett fototaverbart hydrogelbiomaterial som kan utföra två sekventiella polymerisationsreaktioner i ett gelatinstödbad. Tekniken för bioprinting med friformsreversibel inbäddning av suspenderade hydrogeler (FRESH) anpassades genom att justera pH-värdet i stödbadet för att underlätta en Michael-additionsreaktion. Först reagerade biobläcket som innehöll poly(etylenglykol)-alfa-metakrylat (PEGαMA) utanför stökiometrin med en cellnedbrytbar tvärbindare för att bilda mjuka hydrogeler. Dessa mjuka hydrogeler exponerades senare för fotoinitator och ljus för att inducera homopolymerisationen av oreagerade grupper och stelna hydrogelen. Detta protokoll täcker hydrogelsyntes, 3D-bioprinting, fotoförstyvning och endpoint-karakteriseringar för att bedöma fibroblastaktivering i 3D-strukturer. Metoden som presenteras här gör det möjligt för forskare att 3D-bioprinta en mängd olika material som genomgår pH-katalyserade polymerisationsreaktioner och kan implementeras för att konstruera olika modeller av vävnadshomeostas, sjukdom och reparation.
Introduction
3D-bioprinting är en transformativ teknik som gör det möjligt för forskare att exakt deponera celler och biomaterial i 3D-volymer och återskapa den komplexa hierarkiska strukturen hos biologiska vävnader. Under det senaste decenniet har framsteg inom 3D-bioprinting skapat slående mänsklig hjärtvävnad1, funktionella modeller av njurvävnad2, modeller för gasutbyte i lungan3 och tumörmodeller för cancerforskning4. Uppfinningen av inbäddade 3D-bioprintningstekniker, såsom Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH) bioprinting, har gjort det möjligt att reproducera komplexa mjukvävnadsstrukturer som lungblodkärl5 och till och med mänskligt hjärta6 i 3D. FRESH 3D-bioprinting underlättar lager-för-lager-utskrift av mjuka biobläck med låg viskositet genom extrudering i ett skjuvförtunnande stödbad. Stödbadet består av ett material som tätt packade gelatinmikropartiklar som fungerar som en Bingham-plast och bibehåller biobläckets avsedda form och struktur efter tryckning. När den tryckta konstruktionen har stelnat kan stödbadet lösas upp genom att temperaturen höjs till 37 °C7.
En nyligen publicerad översiktsartikel sammanfattade de material som har 3D-bioprintats i olika publikationer med hjälp av FRESH-teknik. Dessa naturligt framställda material sträcker sig från kollagen typ I till metakrylerad hyaluronsyra och representerar flera olika gelningsmekanismer7. De flesta forskningsstudier som utförs med denna 3D-bioprintningsteknik använder statiska biomaterial som inte förändras som svar på yttre stimuli. Dynamiska fototunable hydrogel-biomaterial har använts av vårt laboratorium och andra 8,9,10,11,12 för att modellera en mängd olika fibrotiska sjukdomar. Till skillnad från statiska biomaterial gör fototunable biobläck det möjligt att skapa en mjukare modell med lägre elasticitetsmodulvärde och senare stelna för att utforska cellulära svar på ökad mikromiljöförstyvning.
Fibrotiska sjukdomar kännetecknas av en ökning av produktionen av extracellulär matris som kan orsaka ärrbildning och stelhet13. Vävnadsstelhet kan initiera ytterligare skada och förstörelse av den påverkade vävnaden, vilket orsakar permanent organskada och till och med dödsfall; Fibrotiska sjukdomar står för en tredjedel av dödligheten i världen. Fibroblaster producerar överskott och avvikande extracellulär matris i detta sjukdomstillstånd14,15. Ökad fibroblastproliferation och extracellulär matrixavsättning gör vävnaden ytterligare stel och aktiverar en profibrotisk positiv återkopplingsslinga16,17,18,19. Att studera fibroblastaktivering är avgörande för att förstå fibrotiska sjukdomar. Här presenterar vi human pulmonell arteriell hypertension (PAH) som ett exempel på en fibrotisk sjukdom där det är viktigt att efterlikna blodkärlets 3D-geometri med hjälp av 3D-bioprinting och introducera den dynamiska förstyvningsförmågan hos fotoavstämbara hydrogeler. PAH är ett tillstånd där trycket i de viktigaste lungartärerna överstiger normala nivåer och belastar hjärtat, vilket ökar aktiveringen av humana lungartärer adventitial fibroblast (HPAAF) och stelnar blodkärlsvävnaderna16,17,18,19. En fotoavstämbar biobläckformulering av poly(etylenglykol)-alfametakrylat (PEGαMA) möjliggör temporal förstyvning i konstrukt och hjälper till att modellera både frisk vävnad och sjukdomsprogression 5,8,9,10. Att utnyttja denna unika egenskap möjliggör kvantifiering av HPAAF-aktivering och proliferation som svar på mikromiljöförstyvning i 3D och kan ge värdefull insikt i de cellulära mekanismer som är involverade i denna sjukdom. Protokollet som beskrivs här kommer att göra det möjligt för forskare att skapa 3D-modeller som rekapitulerar förändringar i den extracellulära mikromiljön under sjukdomsprogression eller vävnadsreparation och studera fibroblastaktivering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tvåstegs polymerisationsreaktioner som svar på kontrollerad ljusexponering kan styva biomaterial med rumslig och tidsmässig kontroll. Flera studier har utnyttjat denna teknik för att utvärdera cell-matrixinteraktioner i olika plattformar 5,8,9,10,11,21,22,23.<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) och de som var värdar för 3D Bioprinting Open-Source Workshop. Dessa personer gjorde det möjligt att lära sig teknikerna för FRESH bioprinting och bygga den 3D-bioprinter som användes för dessa studier. Dessutom vill författarna uppmärksamma Biorender.com, som användes för att producera figurer i detta manuskript. Detta arbete stöddes av flera grupper eller finansieringskällor, inklusive Rose Community Foundation (DDH och CMM), Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH och CMM), National Science Foundation under Award 1941401 (CMM), Department of the Army under Award W81XWH-20-1-0037 (CMM), National Cancer Institute of the NIH under Award R21 CA252172 (CMM), Ludeman Family Center for Women’s Health Research vid University of Colorado Anschutz Medical Campus (DDH och CMM), National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under utmärkelserna R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) och T32 HL072738 (DDH och AT).
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
References
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
- Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
- Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
- Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
- Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
- Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
- Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904 (2021).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
- Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792 (2012).
- Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2 (2014).
- Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
- Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
- Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
- Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387 (2016).
- Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
- Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H. Mechanosensing and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 74-84 (2018).
- Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
- Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
- Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
- Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
- Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758 (2023).
- Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871 (2023).
- Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550 (2023).
- Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047 (2022).
