منصة للكشف الكمي عن الخلايا المناعية البطانية على أساس الكيمياء المناعية وتحليل الصور الرقمية
Summary
هنا ، تم تطوير منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية والتحقق من صحتها لتحليل الخلايا المناعية البطانية للمرضى الذين يعانون من الإجهاض المتكرر في نافذة الزرع كميا.
Abstract
لتقييم البيئة الدقيقة المناعية لبطانة الرحم للمرضى الذين يعانون من الإجهاض المتكرر (RM) ، تم تطوير منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية المناعية والتحقق من صحتها لتحليل الخلايا المناعية البطانية كميا خلال المرحلة المتوسطة الصفراء. تم جمع جميع عينات بطانة الرحم خلال المرحلة المتوسطة الصفراء من الدورة الشهرية. تم تقسيم أنسجة بطانة الرحم المضمنة في البارافين إلى شرائح بسمك 4 ميكرومتر ، وتم إجراء تلطيخ الكيمياء المناعية (IHC) للكشف عن الخلايا المناعية البطانية الرحمية ، بما في ذلك خلايا CD56 + uNK ، و Foxp3 + Tregs ، و CD163 + M2 البلاعم ، و CD1a + DCs ، وخلايا CD8 + T. تم مسح الشرائح البانورامية ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي رقمي للشرائح وتم استخدام نظام تحليل الصور التجارية للتحليل الكمي. تم حساب النسبة المئوية للخلايا المناعية البطانية بقسمة عدد الخلايا المناعية في إجمالي خلايا بطانة الرحم. باستخدام نظام تحليل الصور التجارية ، يمكن تحليل التقييم الكمي للخلايا المناعية البطانية الرحمية ، والتي يصعب أو يستحيل تحليلها باستخدام تحليل الصور التقليدي ، بسهولة وبدقة. يمكن تطبيق هذه المنهجية لتوصيف البيئة المكروية بطانة الرحم كميا ، بما في ذلك التفاعل بين الخلايا المناعية ، وعدم تجانسها لمرضى الفشل التناسلي المختلفين. قد تكون منصة التقييم الكمي للخلايا المناعية البطانية ذات أهمية سريرية مهمة لتشخيص وعلاج مرضى RM.
Introduction
الإجهاض المتكرر (RM) هو فقدان حملين متتاليين أو أكثر وهو مرض معقد يجذب انتباه الأطباء في السنوات الأخيرة. معدل حدوث RM في النساء في سن الإنجاب هو 1٪ -5٪ 1. تظهر نتائج الدراسات السابقة أن العوامل المناعية ترتبط ارتباطا وثيقا بالتسبب في RM2،3،4،5. الحفاظ على التوازن المناعي في واجهة الأم والجنين مطلوب لزرع الجنين وتطوره. تؤدي الخلايا المناعية البطانية الرحمية عدة أدوار تنظيمية للحفاظ على هذا التوازن ، مثل تعزيز غزو الأرومة الغاذية ، وإعادة تشكيل الشرايين الحلزونية ، والمساهمة في نمو المشيمة6،7،8،9.
تم الإبلاغ سابقا عن خلايا مناعية بطانة الرحم الشاذة لدى النساء المصابات ب RM. تظهر النتائج ارتباطا وثيقا بين الكثافة العالية للخلايا القاتلة الطبيعية للرحم (uNKs) وحدوثRM 10،11،12. تم الإبلاغ عن عدد متزايد من البلاعم في بطانة الرحم للنساء المصابات ب RM ، مقارنة بأولئك الذين ولدوا أحياء13. تلعب الخلايا التائية التنظيمية (Treg) دورا في تحمل الأم المناعي تجاه الجنين ، وينخفض مستواها ووظيفتها في نفضي مرضى RM14. تلعب الخلايا التائية السمية الخلوية (CTL) والخلايا المتغصنة (DCs) أيضا دورا في التنظيم المناعي للحمل15,16. لذلك ، يمكن أن يساعد التحليل الكمي الشامل للخلايا المناعية البطانية المحلية خلال المرحلة المتوسطة الصفراء على فهم التسبب في RM بشكل أفضل. تستخدم بعض الطرق الحالية للتحليل الكمي للخلايا المناعية البطانية قياس التدفق الخلوي الذي يمكنه تسمية الخلايا المناعية بدقة بعلامات متعددة17,18. ومع ذلك ، فإن التطبيق السريري لقياس التدفق الخلوي محدود لأنه لا يمكن إجراؤه إلا على الأنسجة الطازجة. لا يمكن الحصول على أنسجة جديدة إلا عند توفر كمية كبيرة من الورم الزائد ، وهو أمر نادر الحدوث لبطانة الرحم. يمكن للكيمياء الهيستولوجية المناعية مراقبة مورفولوجيا الأنسجة جيدا في الموقع ويمكنها أيضا تسمية الخلايا المناعية المختلفة ، في حين أن التقنيات الكيميائية المناعية التقليدية لا يمكنها إجراء تحليل كمي للخلايا المناعية.
بالمقارنة مع تجارب الكيمياء المناعية التقليدية ، فإن التحليل الكيميائي المناعي الكمي للخلايا المناعية في بطانة الرحم له أهمية سريرية مهمة. عادة ما يتم تصنيف درجات كثافة IHC على مقياس من أربع نقاط أو قوي وضعيف في التشخيص المرضي والبحوث19،20،21. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية شبه الكمية ذاتية وغير دقيقة إلى حد كبير ، وتوضح تباينا كبيرا داخل المراقب وبينالمراقبين 22. أحد الحلول الممكنة هو تطبيق التعلم الآلي ، وهو تحليل الصور الرقميةالقيمة 23,24. من خلال توفير قياسات كمية ، يتيح هذا النهج تقييما أكثر دقة لتسلل الخلايا المناعية وتوزيعها وكثافتها داخل أنسجة الرحم. يمكن أن تساعد هذه المعلومات الكمية في توضيح التغيرات الديناميكية في مجموعات الخلايا المناعية أثناء دورة الطمث وفي الحالات المرضية المختلفة. بشكل عام ، توفر القدرة على التحليل الكمي للخلايا المناعية في بطانة الرحم من خلال الكيمياء الهيستولوجية المناعية رؤى قيمة في البيئة المكروية المناعية للرحم.
لذلك ، يهدف البروتوكول إلى تطوير والتحقق من صحة منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية المناعية لتحليل الخلايا المناعية البطانية الرحمية كميا بما في ذلك خلايا uNK و Tregs والبلاعم و DCs والخلايا التائية السامة للخلايا خلال المرحلة المتوسطة الصفراء في مرضى RM.
Protocol
Representative Results
Discussion
أنشأ هذا البروتوكول منصة رقمية لتحليل صور الكيمياء المناعية لتحليل الخلايا المناعية البطانية لمرضى RM كميا. هنا ، تم الكشف عن ست علامات مناعية بطانة الرحم لتقييم البيئة الدقيقة المناعية بطانة الرحم في مرضى RM.
بطانة الرحم الاستقبالية خلال المرحلة المتوسطة الصفراء هي مفتاح ن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون ممتنون لجميع النساء اللواتي وافقن وتبرعن بعينات لهذه الدراسة.
Materials
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
References
- Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
- Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. Recurrent pregnancy loss. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).
- Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
- Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
- Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
- Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
- Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
- Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
- Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
- Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
- Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
- Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
- Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
- Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).
- Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
- Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).
- Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
- Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).
- Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
- Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
- Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
- Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
- Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
- Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
- Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
- Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
- Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
- Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
- O’Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).
- Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).
