פלטפורמה לזיהוי כמותי של תאי מערכת החיסון ברירית הרחם על בסיס אימונוהיסטוכימיה וניתוח תמונה דיגיטלית
Summary
כאן, פותחה ואומתה פלטפורמת ניתוח תמונה אימונוהיסטוכימית דיגיטלית לניתוח כמותי של תאי החיסון של רירית הרחם של חולים עם הפלות חוזרות בחלון ההשתלה.
Abstract
כדי להעריך את המיקרו-סביבה החיסונית של רירית הרחם של חולים עם הפלות חוזרות (RM), פותחה ואומתה פלטפורמת ניתוח תמונה דיגיטלית של אימונוהיסטוכימיה כדי לנתח כמותית תאים חיסוניים של רירית הרחם במהלך השלב האמצעי-לוטאלי. כל דגימות רירית הרחם נאספו במהלך השלב האמצעי-לוטאלי של המחזור החודשי. רקמות רירית הרחם המשובצות בפרפין חולקו לשקופיות בעובי 4 מיקרומטר, וצביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) בוצעה לאיתור תאים חיסוניים של רירית הרחם, כולל תאי CD56+ uNK, Foxp3+ Tregs, מקרופאגים CD163+ M2, DCs CD1a+ ותאי T CD8+. השקופיות הפנורמיות נסרקו באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי ומערכת ניתוח תמונות מסחרית שימשה לניתוח כמותי. אחוז תאי מערכת החיסון של רירית הרחם חושב על ידי חלוקת מספר תאי החיסון בסך תאי רירית הרחם. באמצעות מערכת ניתוח התמונה המסחרית, הערכה כמותית של תאי מערכת החיסון של רירית הרחם, שקשה או בלתי אפשרי לנתח באמצעות ניתוח תמונה קונבנציונלי, יכולה להיות מנותחת בקלות ובמדויק. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת כדי לאפיין כמותית את המיקרו-סביבה של רירית הרחם, כולל אינטראקציה בין תאים חיסוניים, ואת ההטרוגניות שלה עבור חולים שונים באי ספיקת רבייה. הפלטפורמה להערכה כמותית של תאי מערכת החיסון של רירית הרחם עשויה להיות בעלת משמעות קלינית חשובה לאבחון וטיפול בחולי RM.
Introduction
הפלה חוזרת (RM) היא אובדן של שני הריונות רצופים או יותר והיא מחלה מורכבת המושכת תשומת לב מצד רופאים בשנים האחרונות. שיעור ההיארעות של RM בנשים בגיל הפוריות הוא 1%-5% 1. תוצאות מחקרים קודמים מראות כי גורמים חיסוניים קשורים קשר הדוק עם הפתוגנזה של RM 2,3,4,5. שמירה על הומאוסטזיס חיסוני בממשק האם-עובר נדרשת להשתלת עובר והתפתחותו. תאי חיסון רירית הרחם מבצעים מספר תפקידי ויסות לשמירה על הומאוסטזיס זה, כגון קידום פלישת טרופובלסט, עיצוב מחדש של עורקים ספירליים ותרומה להתפתחות שליה 6,7,8,9.
תאי חיסון חריגים של רירית הרחם אצל נשים עם RM דווחו בעבר. התוצאות מראות קשר הדוק בין הצפיפות הגבוהה של תאי הרג טבעי ברחם (uNKs) לבין המופע של RM10,11,12. מספר מוגבר של מקרופאגים דווח ברירית הרחם של נשים עם RM, בהשוואה לאלו שעברו לידת חי13. תאי T רגולטוריים (Treg) ממלאים תפקיד בסבילות החיסונית האימהית כלפי העובר, ורמתם ותפקודם יורדים בהחלטה של חולי RM14. תאי T ציטוטוקסיים (CTL) ותאים דנדריטיים (DCs) גם לשחק תפקיד בוויסות החיסון של הריון15,16. לכן, ניתוח כמותי מקיף של תאי חיסון רירית הרחם המקומי במהלך השלב האמצעי-לוטאלי יכול לעזור להבין טוב יותר את הפתוגנזה של RM. חלק מהשיטות הנוכחיות לניתוח כמותי של תאי מערכת החיסון של רירית הרחם משתמשות בציטומטריית זרימה שיכולה לתייג במדויק תאי חיסון עם סמנים מרובים17,18. עם זאת, היישום הקליני של ציטומטריית זרימה מוגבל מכיוון שניתן לבצע אותו רק על רקמות טריות. השגת רקמה טרייה אפשרית רק כאשר כמות גדולה של גידול עודף זמין, תופעה נדירה עבור אנדומטריום. אימונוהיסטוכימיה יכולה לצפות במורפולוגיה של רקמות היטב באתרה ויכולה גם לתייג תאים חיסוניים שונים, בעוד שטכניקות אימונוהיסטוכימיות מסורתיות אינן יכולות לבצע ניתוח כמותי של תאי מערכת החיסון.
בהשוואה לניסויים אימונוהיסטוכימיים קונבנציונליים, לניתוח אימונוהיסטוכימי כמותי של תאי מערכת החיסון ברירית הרחם יש משמעות קלינית חשובה. ניקוד עוצמת IHC מדורג בדרך כלל בסולם של ארבע נקודות או חזק וחלש באבחון פתולוגי ומחקר 19,20,21. עם זאת, טכניקה כמותית למחצה זו היא סובייקטיבית, מאוד לא מדויקת, ומדגימה שונות משמעותית בין צופה ובין צופה22. פתרון אפשרי אחד הוא יישום של למידת מכונה, שהיא בעלת ערך בניתוח תמונה דיגיטלית23,24. על ידי מתן מדידות כמותיות, גישה זו מאפשרת הערכה מדויקת יותר של חדירה, פיזור וצפיפות של תאי מערכת החיסון בתוך רקמת הרחם. מידע כמותי זה יכול לעזור להבהיר את השינויים הדינמיים באוכלוסיית תאי החיסון במהלך המחזור החודשי ובמצבים פתולוגיים שונים. בסך הכל, היכולת לנתח כמותית תאי מערכת החיסון ברירית הרחם באמצעות אימונוהיסטוכימיה מציעה תובנות חשובות על המיקרו-סביבה החיסונית של הרחם.
לכן, מטרת הפרוטוקול הייתה לפתח ולתקוף פלטפורמת ניתוח תמונה דיגיטלית של אימונוהיסטוכימיה לניתוח כמותי של תאי מערכת החיסון של רירית הרחם, כולל תאי uNK, Tregs, מקרופאגים, DCs ותאי T ציטוטוקסיים במהלך השלב האמצעי-לוטאלי בחולי RM.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הקים פלטפורמת ניתוח תמונה דיגיטלית של אימונוהיסטוכימיה לניתוח כמותי של תאי חיסון רירית הרחם של חולי RM. כאן, שישה סמנים חיסוניים רירית הרחם זוהו כדי להעריך את microenvironment החיסון רירית הרחם בחולי RM.
רירית הרחם הפתוחה בשלב האמצעי-לוטאלי היא המפתח להשתרשות מוצלחות ולה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה לכל הנשים שהסכימו ותרמו דגימות למחקר זה.
Materials
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
References
- Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
- Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. Recurrent pregnancy loss. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).
- Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
- Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
- Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
- Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
- Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
- Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
- Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
- Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
- Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
- Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
- Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
- Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).
- Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
- Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).
- Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
- Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).
- Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
- Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
- Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
- Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
- Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
- Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
- Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
- Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
- Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
- Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
- O’Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).
- Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).
