Piattaforma per la rilevazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali basata sull'immunoistochimica e sull'analisi digitale delle immagini

Summary

Qui, è stata sviluppata e convalidata una piattaforma digitale di analisi delle immagini immunoistochimiche per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali di pazienti con aborti spontanei ricorrenti nella finestra di impianto.

Abstract

Per valutare il microambiente immunitario endometriale delle pazienti con aborto spontaneo ricorrente (RM), è stata sviluppata e convalidata una piattaforma di analisi delle immagini di immunoistochimica digitale per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali durante la fase luteale media. Tutti i campioni di endometrio sono stati raccolti durante la fase luteale media del ciclo mestruale. I tessuti endometriali inclusi in paraffina sono stati sezionati in vetrini spessi 4 μm ed è stata eseguita la colorazione immunoistochimica (IHC) per rilevare le cellule immunitarie dell’endometrio, comprese le cellule uNK CD56+, le Treg Foxp3+, i macrofagi CD163+ M2, le DC CD1a+ e le cellule T CD8+. I vetrini panoramici sono stati scansionati utilizzando uno scanner digitale per diapositive e per l’analisi quantitativa è stato utilizzato un sistema commerciale di analisi delle immagini. La percentuale di cellule immunitarie endometriali è stata calcolata dividendo il numero di cellule immunitarie nelle cellule endometriali totali. Utilizzando il sistema di analisi delle immagini commerciale, la valutazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali, che sono difficili o impossibili da analizzare con l’analisi convenzionale delle immagini, potrebbe essere analizzata facilmente e accuratamente. Questa metodologia può essere applicata per caratterizzare quantitativamente il microambiente endometriale, compresa l’interazione tra le cellule immunitarie, e la sua eterogeneità per le diverse pazienti con insufficienza riproduttiva. La piattaforma per la valutazione quantitativa delle cellule immunitarie endometriali può essere di importante importanza clinica per la diagnosi e il trattamento delle pazienti con RM.

Introduction

L’aborto spontaneo ricorrente (RM) è la perdita di due o più gravidanze consecutive ed è una malattia complessa che ha attirato l’attenzione dei medici negli ultimi anni. Il tasso di incidenza della RM nelle donne in età fertile è dell’1%-5% ¹. I risultati di studi precedenti mostrano che i fattori immunitari sono strettamente associati alla patogenesi di RM 2,3,4,5. Il mantenimento dell’omeostasi immunitaria all’interfaccia materno-fetale è necessario per l’impianto e lo sviluppo dell’embrione. Le cellule immunitarie dell’endometrio svolgono diversi ruoli regolatori per mantenere questa omeostasi, come promuovere l’invasione del trofoblasto, rimodellare le arterie spirali e contribuire allo sviluppo della placenta 6,7,8,9.

In precedenza sono state segnalate cellule immunitarie endometriali aberranti nelle donne con RM. I risultati mostrano una stretta associazione tra l’alta densità di cellule natural killer uterine (uNK) e la presenza di RM^10,11,12. Un aumento del numero di macrofagi è stato riportato nell’endometrio delle donne con RM, rispetto a quelle che hanno avuto un parto vivo¹³. Le cellule T regolatorie (Treg) svolgono un ruolo nella tolleranza immunitaria materna nei confronti dell’embrione e il loro livello e la loro funzione sono diminuiti nella decidua dei pazienti con RM¹⁴. Anche le cellule T di citotossicità (CTL) e le cellule dendritiche (DC) svolgono un ruolo nella regolazione immunitaria della gravidanza^15,16. Pertanto, un’analisi quantitativa completa delle cellule immunitarie endometriali locali durante la fase medio-luteale potrebbe aiutare a comprendere meglio la patogenesi della RM. Alcuni metodi attuali per l’analisi quantitativa delle cellule immunitarie endometriali utilizzano la citometria a flusso che può marcare con precisione le cellule immunitarie con più marcatori^17,18. Tuttavia, l’applicazione clinica della citometria a flusso è limitata perché può essere eseguita solo su tessuto fresco. L’ottenimento di tessuto fresco è possibile solo quando è disponibile un grande volume di tumore in eccesso, un evento raro per l’endometrio. L’immunoistochimica può osservare bene la morfologia dei tessuti in situ e può anche marcare varie cellule immunitarie, mentre le tecniche immunoistochimiche tradizionali non possono eseguire analisi quantitative delle cellule immunitarie.

Rispetto agli esperimenti di immunoistochimica convenzionali, l’analisi immunoistochimica quantitativa delle cellule immunitarie nell’endometrio ha un importante significato clinico. Il punteggio dell’intensità IHC è solitamente classificato su una scala a quattro punti o forte e debole nella diagnostica e nella ricerca patologica 19,20,21. Tuttavia, questa tecnica semi-quantitativa è soggettiva, altamente imprecisa e dimostra una significativa variabilità intra-osservatore e inter-osservatore²². Una possibile soluzione è l’applicazione dell’apprendimento automatico, che è prezioso nell’analisi digitale^{delle immagini 23,24}. Fornendo misurazioni quantitative, questo approccio consente una valutazione più precisa dell’infiltrazione, della distribuzione e della densità delle cellule immunitarie all’interno del tessuto uterino. Queste informazioni quantitative possono aiutare a chiarire i cambiamenti dinamici nelle popolazioni di cellule immunitarie durante il ciclo mestruale e in varie condizioni patologiche. Nel complesso, la capacità di analizzare quantitativamente le cellule immunitarie nell’endometrio attraverso l’immunoistochimica offre preziose informazioni sul microambiente immunitario dell’utero.

Pertanto, il protocollo mirava a sviluppare e convalidare una piattaforma di analisi delle immagini di immunoistochimica digitale per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie dell’endometrio, comprese le cellule uNK, le Treg, i macrofagi, le DC e le cellule T citotossiche durante la fase luteale media nelle pazienti con RM.

Protocol

Il contenuto e il protocollo della ricerca sono stati esaminati eticamente e approvati dal comitato etico di ricerca dell’ospedale urologico di Shenzhen Zhongshan. Tutte le donne (20-40 anni) coinvolte nello studio hanno fornito il consenso informato per la raccolta e l’utilizzo del campione. 1. Acquisizione di tessuto patologico Preparare gli strumenti per la raccolta dei tessuti, vale a dire righello di misurazione, pinzetta, cassetta per inclusione, carta per incl…

Representative Results

Al fine di valutare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali e ridurre l’instabilità causata da errori operativi causati dall’uomo, abbiamo creato una piattaforma di analisi quantitativa digitale per le cellule immunitarie endometriali utilizzando il rilevamento immunoistochimico automatico e il sistema di valutazione quantitativa digitale. La piattaforma di analisi delle immagini immunoistochimiche è stata istituita per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali di pazienti con abort…

Discussion

Questo protocollo ha stabilito una piattaforma digitale di analisi delle immagini immunoistochimiche per analizzare quantitativamente le cellule immunitarie endometriali delle pazienti RM. Qui, sono stati rilevati sei marcatori immunitari endometriali per valutare il microambiente immunitario endometriale nelle pazienti con RM.

Un endometrio ricettivo durante la fase luteale media è fondamentale per il successo dell’impianto e della gravidanza^27,28<sup class…

Materials

Automated coverslipper	Sakuraus	DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163	GrowGn Biotechnology	NCL-L-CD163
CD1a	Gene Tech	GM357129
CD56	Gene Tech	GT200529
CD8	Novocastra	NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator	Thermo Fisher	Excelsior ES
Digital pathology and	Indica labs	HALO
Foxp3	YILIFANG biological	14-477-82
IHC stainer	Leica	BOND III
Image analysis platform	Indica labs	HALO
Slide Scanner	Olympus life science	VS200