Plataforma para Detecção Quantitativa de Células Imunes Endometriais Baseada em Imunohistoquímica e Análise Digital de Imagens
Summary
Aqui, uma plataforma de análise de imagens de imunohistoquímica digital foi desenvolvida e validada para analisar quantitativamente as células imunes endometriais de pacientes com abortos espontâneos recorrentes na janela de implantação.
Abstract
Para avaliar o microambiente imune endometrial de pacientes com abortamento recorrente (RM), uma plataforma de análise de imagem imunoistoquímica digital foi desenvolvida e validada para analisar quantitativamente as células imunes endometriais durante a fase lútea média. Todas as amostras de endométrio foram coletadas durante a fase lútea média do ciclo menstrual. Os tecidos endometriais incluídos em parafina foram seccionados em lâminas de 4 μm de espessura, e a coloração imunoistoquímica (IHQ) foi realizada para detectar células imunes endometriais, incluindo células uNK CD56+, Tregs Foxp3+, macrófagos CD163+ M2, DCs CD1a+ e células T CD8+. As lâminas panorâmicas foram escaneadas por meio de um scanner digital de lâminas e um sistema comercial de análise de imagens foi utilizado para análise quantitativa. A porcentagem de células imunes endometriais foi calculada dividindo-se o número de células imunes nas células endometriais totais. Usando o sistema de análise de imagem comercial, a avaliação quantitativa de células imunes endometriais, que são difíceis ou impossíveis de analisar com a análise de imagem convencional, poderia ser analisada com facilidade e precisão. Esta metodologia pode ser aplicada para caracterizar quantitativamente o microambiente endométrio, incluindo a interação entre células imunes, e sua heterogeneidade para diferentes pacientes com falência reprodutiva. A plataforma para avaliação quantitativa de células imunes endometriais pode ser de importante importância clínica para o diagnóstico e tratamento de pacientes com RM.
Introduction
O aborto espontâneo recorrente (MR) é a perda de duas ou mais gestações consecutivas e é uma doença complexa que tem chamado a atenção dos clínicos nos últimos anos. A taxa de incidência de RM em mulheres em idade fértil é de 1%-5%1. Resultados de estudos prévios mostram que fatores imunológicos estão intimamente associados à patogênese da RM2,3,4,5. A manutenção da homeostase imune na interface materno-fetal é necessária para a implantação e desenvolvimento do embrião. As células imunes endometriais desempenham vários papéis regulatórios para manter essa homeostase, como promover a invasão do trofoblasto, remodelar as artérias espirais e contribuir para o desenvolvimento da placenta 6,7,8,9.
Células imunes endometriais aberrantes em mulheres com RM foram previamente relatadas. Os resultados mostram uma estreita associação entre a alta densidade de células natural killer uterinas (uNKs) e a ocorrência de RM10,11,12. Um número aumentado de macrófagos tem sido relatado no endométrio de mulheres com RM, em comparação com aquelas que tiveram um nascimento vivo13. As células T reguladoras (Treg) desempenham um papel na tolerância imunológica materna ao embrião, e seu nível e função estão diminuídos na decídua de pacientes com RM14. Citotoxicidade de células T (CTL) e células dendríticas (DCs) também desempenham um papel na regulação imunológica da gravidez15,16. Portanto, uma análise quantitativa abrangente das células imunes endometriais locais durante a fase lútea média poderia ajudar a entender melhor a patogênese da RM. Alguns métodos atuais para análise quantitativa de células imunes endometriais utilizam citometria de fluxo que pode marcar com precisão as células imunes com múltiplos marcadores17,18. No entanto, a aplicação clínica da citometria de fluxo é limitada, pois só pode ser realizada em tecido fresco. A obtenção de tecido fresco só é viável quando há grande volume de tumor em excesso, ocorrência rara no endométrio. A imuno-histoquímica pode observar bem a morfologia tecidual in situ e também pode marcar várias células imunes, enquanto as técnicas tradicionais de imuno-histoquímica não podem realizar análise quantitativa de células imunes.
Comparada aos experimentos convencionais de imunohistoquímica, a análise imunoistoquímica quantitativa das células imunes do endométrio tem importante significado clínico. O escore de intensidade da IHQ é geralmente classificado em uma escala de quatro pontos ou forte e fraco em diagnósticos patológicos e pesquisas 19,20,21. No entanto, essa técnica semiquantitativa é subjetiva, altamente imprecisa e demonstra significativa variabilidade intraobservador e interobservador22. Uma possível solução é a aplicação do aprendizado de máquina, que é valioso na análise de imagens digitais23,24. Ao fornecer medidas quantitativas, essa abordagem permite uma avaliação mais precisa da infiltração, distribuição e densidade de células imunes dentro do tecido uterino. Essas informações quantitativas podem ajudar a elucidar as mudanças dinâmicas nas populações de células imunes durante o ciclo menstrual e em várias condições patológicas. Em geral, a capacidade de analisar quantitativamente as células imunes no endométrio por meio da imunohistoquímica oferece informações valiosas sobre o microambiente imunológico do útero.
Portanto, o protocolo teve como objetivo desenvolver e validar uma plataforma de análise de imagens de imunohistoquímica digital para analisar quantitativamente células imunes endometriais, incluindo células uNK, Tregs, macrófagos, DCs e células T citotóxicas durante a fase lútea média em pacientes com RM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo estabeleceu uma plataforma de análise de imagens de imuno-histoquímica digital para analisar quantitativamente células imunes endometriais de pacientes com RM. Aqui, seis marcadores imunes endometriais foram detectados para avaliar o microambiente imune endometrial em pacientes com RM.
Um endométrio receptivo durante a fase lútea média é fundamental para o sucesso da implantação e gravidez27,28. Portanto, a aval…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a todas as mulheres que consentiram e doaram amostras para este estudo.
Materials
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
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