Plataforma para la detección cuantitativa de células inmunes endometriales basada en inmunohistoquímica y análisis de imágenes digitales
Summary
Aquí, se desarrolló y validó una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales de pacientes con abortos espontáneos recurrentes en la ventana de implantación.
Abstract
Para evaluar el microambiente inmune endometrial de pacientes con aborto espontáneo recurrente (RM), se desarrolló y validó una plataforma de análisis de imágenes inmunohistoquímicas digitales para analizar cuantitativamente las células inmunes endometriales durante la fase lútea media. Todas las muestras de endometrio se recogieron durante la fase lútea media del ciclo menstrual. Los tejidos endometriales incluidos en parafina se seccionaron en portaobjetos de 4 μm de espesor y se llevó a cabo una tinción inmunohistoquímica (IHQ) para detectar células inmunitarias endometriales, incluidas las células uNK CD56+, las Tregs Foxp3+, los macrófagos CD163+ M2, las CD CD1a+ y las células T CD8+. Las diapositivas panorámicas se escanearon con un escáner digital de diapositivas y se utilizó un sistema comercial de análisis de imágenes para el análisis cuantitativo. El porcentaje de células inmunitarias endometriales se calculó dividiendo el número de células inmunitarias en el total de células endometriales. Utilizando el sistema comercial de análisis de imágenes, la evaluación cuantitativa de las células inmunitarias endometriales, que son difíciles o imposibles de analizar con el análisis de imágenes convencional, podría analizarse de forma fácil y precisa. Esta metodología se puede aplicar para caracterizar cuantitativamente el microambiente del endometrio, incluida la interacción entre las células inmunitarias, y su heterogeneidad para diferentes pacientes con insuficiencia reproductiva. La plataforma para la evaluación cuantitativa de las células inmunitarias endometriales puede tener una importancia clínica importante para el diagnóstico y el tratamiento de las pacientes con RM.
Introduction
El aborto espontáneo recurrente (RM) es la pérdida de dos o más embarazos consecutivos y es una enfermedad compleja que ha llamado la atención de los médicos en los últimos años. La tasa de incidencia de RM en mujeres en edad fértil es del 1%-5% 1. Los resultados de estudios previos muestran que los factores inmunes están estrechamente asociados con la patogénesis de RM 2,3,4,5. El mantenimiento de la homeostasis inmunitaria en la interfaz materno-fetal es necesario para la implantación y el desarrollo embrionario. Las células inmunitarias endometriales desempeñan varias funciones reguladoras para mantener esta homeostasis, como promover la invasión del trofoblasto, remodelar las arterias espirales y contribuir al desarrollo de la placenta 6,7,8,9.
Se han reportado previamente células inmunitarias endometriales aberrantes en mujeres con RM. Los resultados muestran una estrecha asociación entre la alta densidad de células asesinas naturales uterinas (uNK) y la ocurrencia de RM10,11,12. Se ha descrito un aumento del número de macrófagos en el endometrio de mujeres con RM, en comparación con las que tuvieron un nacido vivo13. Las células T reguladoras (Treg) desempeñan un papel en la inmunidad materna hacia el embrión, y su nivel y función están disminuidos en la decidua de los pacientes con RM14. Los linfocitos T (CTL) y los linfocitos dendríticos (CD) también desempeñan un papel en la regulación inmunitaria del embarazo15,16. Por lo tanto, un análisis cuantitativo exhaustivo de las células inmunitarias endometriales locales durante la fase lútea media podría ayudar a comprender mejor la patogénesis de la RM. Algunos métodos actuales para el análisis cuantitativo de las células inmunitarias endometriales utilizan la citometría de flujo, que puede etiquetar con precisión las células inmunitarias con múltiples marcadores17,18. Sin embargo, la aplicación clínica de la citometría de flujo es limitada porque solo se puede realizar en tejido fresco. La obtención de tejido fresco solo es factible cuando se dispone de un gran volumen de exceso de tumor, algo poco frecuente en el endometrio. La inmunohistoquímica puede observar bien la morfología de los tejidos in situ y también puede marcar varias células inmunitarias, mientras que las técnicas inmunohistoquímicas tradicionales no pueden realizar análisis cuantitativos de las células inmunitarias.
En comparación con los experimentos de inmunohistoquímica convencionales, el análisis inmunohistoquímico cuantitativo de las células inmunitarias del endometrio tiene una importancia clínica importante. La puntuación de la intensidad de la IHQ suele clasificarse en una escala de cuatro puntos o fuerte y débil en el diagnóstico patológico y la investigación 19,20,21. Sin embargo, esta técnica semicuantitativa es subjetiva, altamente inexacta y demuestra una variabilidad significativa intraobservador e interobservador22. Una posible solución es la aplicación del aprendizaje automático, que es valioso en el análisis de imágenes digitales23,24. Al proporcionar mediciones cuantitativas, este enfoque permite una evaluación más precisa de la infiltración, distribución y densidad de las células inmunitarias dentro del tejido uterino. Esta información cuantitativa puede ayudar a dilucidar los cambios dinámicos en las poblaciones de células inmunitarias durante el ciclo menstrual y en diversas condiciones patológicas. En general, la capacidad de analizar cuantitativamente las células inmunitarias del endometrio a través de la inmunohistoquímica ofrece información valiosa sobre el microambiente inmunitario del útero.
Por lo tanto, el protocolo tenía como objetivo desarrollar y validar una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales, incluidas las células uNK, Tregs, macrófagos, CD y células T citotóxicas durante la fase lútea media en pacientes con RM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo estableció una plataforma digital de análisis de imágenes inmunohistoquímicas para analizar cuantitativamente las células inmunitarias endometriales de pacientes con RM. En este caso, se detectaron seis marcadores inmunitarios endometriales para evaluar el microambiente inmunitario endometrial en pacientes con RM.
Un endometrio receptivo durante la fase lútea media es clave para el éxito de la implantación y el embarazo27,28<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a todas las mujeres que dieron su consentimiento y donaron muestras para este estudio.
Materials
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
References
- Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
- Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. Recurrent pregnancy loss. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).
- Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
- Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
- Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
- Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
- Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
- Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
- Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
- Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
- Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
- Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
- Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
- Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).
- Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
- Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).
- Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
- Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).
- Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
- Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
- Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
- Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
- Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
- Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
- Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
- Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
- Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
- Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
- O’Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).
- Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).
