Burada, implantasyon penceresinde tekrarlayan düşükleri olan hastaların endometriyal immün hücrelerini kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu geliştirildi ve doğrulandı.
Tekrarlayan düşüklü (RM) hastaların endometriyal immün mikroçevresini değerlendirmek için, orta luteal faz sırasında endometriyal immün hücreleri kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu geliştirildi ve doğrulandı. Tüm endometrium örnekleri menstrüel siklusun orta luteal fazında toplandı. Parafine gömülü endometrial dokular 4 μm kalınlığında lamlar halinde kesitlere ayrıldı ve CD56+ uNK hücreleri, Foxp3+ Treg’ler, CD163+ M2 makrofajları, CD1a+ DC’ler ve CD8+ T hücreleri dahil olmak üzere endometriyal immün hücreleri saptamak için immünohistokimya (IHC) boyaması yapıldı. Panoramik slaytlar dijital slayt tarayıcı kullanılarak taranmış ve kantitatif analiz için ticari görüntü analiz sistemi kullanılmıştır. Endometrial immün hücrelerin yüzdesi, toplam endometriyal hücrelerdeki immün hücre sayısının bölünmesiyle hesaplandı. Ticari görüntü analiz sistemi kullanılarak, konvansiyonel görüntü analizi ile analiz edilmesi zor veya imkansız olan endometriyal immün hücrelerin kantitatif değerlendirmesi kolay ve doğru bir şekilde analiz edilebilmektedir. Bu metodoloji, bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşim ve farklı üreme yetmezliği hastaları için heterojenliği dahil olmak üzere endometriyum mikro çevresini kantitatif olarak karakterize etmek için uygulanabilir. Endometriyal immün hücrelerin kantitatif değerlendirilmesi platformu, RM hastalarının tanı ve tedavisi için önemli klinik öneme sahip olabilir.
Tekrarlayan düşük (RM), iki veya daha fazla ardışık gebeliğin kaybıdır ve son yıllarda klinisyenlerin dikkatini çeken kompleks bir hastalıktır. Doğurganlık çağındaki kadınlarda RM görülme oranı %1-%5’tir 1. Önceki çalışmaların sonuçları, immün faktörlerin RM 2,3,4,5 patogenezi ile yakından ilişkili olduğunu göstermektedir. Embriyo implantasyonu ve gelişimi için maternal-fetal arayüzde immün homeostazın sürdürülmesi gereklidir. Endometriyal bağışıklık hücreleri, bu homeostazı sürdürmek için trofoblast istilasını teşvik etmek, spiral arterleri yeniden şekillendirmek ve plasenta gelişimine katkıda bulunmak gibi çeşitli düzenleyici roller üstlenir 6,7,8,9.
RM’li kadınlarda anormal endometriyal immün hücreler daha önce bildirilmiştir. Sonuçlar, uterus doğal öldürücü hücrelerin (uNK’ler) yüksek yoğunluğu ile RM10,11,12 oluşumu arasında yakın bir ilişki olduğunu göstermektedir. RM’li kadınların endometriyumunda, canlı doğum yapanlara kıyasla artmış sayıda makrofaj bildirilmiştir13. Regülatör T hücreleri (Treg), embriyoya karşı maternal immün toleransta rol oynar ve RM hastalarının desiduasında seviyeleri ve işlevleri azalır14. Sitotoksisite T hücreleri (CTL) ve dendritik hücreler (DC’ler) de gebeliğin immün regülasyonunda rol oynar15,16. Bu nedenle, orta luteal faz sırasında lokal endometriyal immün hücrelerin kapsamlı bir kantitatif analizi, RM’nin patogenezinin daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir. Endometriyal immün hücrelerin kantitatif analizi için bazı mevcut yöntemler, immün hücreleri çoklu belirteçlerle doğru bir şekilde etiketleyebilen akış sitometrisini kullanır17,18. Bununla birlikte, akım sitometrisinin klinik uygulaması sınırlıdır, çünkü sadece taze dokuda yapılabilir. Taze doku elde etmek ancak endometriyum için nadir görülen büyük miktarda fazla tümör mevcut olduğunda mümkündür. İmmünohistokimya, doku morfolojisini yerinde iyi gözlemleyebilir ve ayrıca çeşitli bağışıklık hücrelerini etiketleyebilirken, geleneksel immünohistokimyasal teknikler bağışıklık hücrelerinin kantitatif analizini gerçekleştiremez.
Konvansiyonel immünohistokimya deneyleri ile karşılaştırıldığında, endometriyumdaki immün hücrelerin kantitatif immünohistokimyasal analizi önemli klinik öneme sahiptir. IHC yoğunluk skorlaması genellikle dört puanlık bir ölçekte veya patolojik tanı ve araştırmalarda güçlü ve zayıf olarak sıralanır 19,20,21. Bununla birlikte, bu yarı nicel teknik özneldir, oldukça yanlıştır ve önemli gözlemci içi ve gözlemciler arası değişkenlik gösterir22. Olası bir çözüm, değerli olan makine öğreniminin uygulanmasıdır.dijital görüntü analizi23,24. Bu yaklaşım, kantitatif ölçümler sağlayarak, uterus dokusu içindeki bağışıklık hücresi infiltrasyonunun, dağılımının ve yoğunluğunun daha kesin bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu nicel bilgi, menstrüel siklus sırasında ve çeşitli patolojik durumlarda bağışıklık hücresi popülasyonlarındaki dinamik değişiklikleri aydınlatmaya yardımcı olabilir. Genel olarak, endometriyumdaki bağışıklık hücrelerini immünohistokimya yoluyla kantitatif olarak analiz etme yeteneği, uterusun bağışıklık mikroçevresi hakkında değerli bilgiler sunar.
Bu nedenle, protokol, RM hastalarında orta luteal faz sırasında uNK hücreleri, Treg’ler, makrofajlar, DC’ler ve sitotoksik T hücreleri dahil olmak üzere endometriyal immün hücreleri kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu geliştirmeyi ve doğrulamayı amaçladı.
Bu protokol, RM hastalarının endometriyal immün hücrelerini kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu oluşturmuştur. Burada, RM hastalarında endometriyal immün mikroçevreyi değerlendirmek için altı endometriyal immün belirteç tespit edildi.
Orta luteal fazda alıcı bir endometriyum, başarılı implantasyon ve hamilelik için anahtardır27,28. Bu nedenle, endometriyal …
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, bu çalışma için rıza gösteren ve örnek bağışlayan tüm kadınlara minnettardır.
Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
IHC stainer | Leica | BOND III | |
Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |