JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

İmmünohistokimya ve Dijital Görüntü Analizine Dayalı Endometrial İmmün Hücrelerin Kantitatif Tespiti Platformu

Published: October 13, 2023
doi:
10.3791/65643
, , , , , , , , , ,
1Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation, Shenzhen Zhongshan Institute for Reproduction and Genetics, Fertility Center,Shenzhen Zhongshan Urology Hospital, 2Shenzhen Jinxin Medical Technology Innovation Center, Co., Ltd.

Summary

Burada, implantasyon penceresinde tekrarlayan düşükleri olan hastaların endometriyal immün hücrelerini kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu geliştirildi ve doğrulandı.

Abstract

Tekrarlayan düşüklü (RM) hastaların endometriyal immün mikroçevresini değerlendirmek için, orta luteal faz sırasında endometriyal immün hücreleri kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu geliştirildi ve doğrulandı. Tüm endometrium örnekleri menstrüel siklusun orta luteal fazında toplandı. Parafine gömülü endometrial dokular 4 μm kalınlığında lamlar halinde kesitlere ayrıldı ve CD56+ uNK hücreleri, Foxp3+ Treg’ler, CD163+ M2 makrofajları, CD1a+ DC’ler ve CD8+ T hücreleri dahil olmak üzere endometriyal immün hücreleri saptamak için immünohistokimya (IHC) boyaması yapıldı. Panoramik slaytlar dijital slayt tarayıcı kullanılarak taranmış ve kantitatif analiz için ticari görüntü analiz sistemi kullanılmıştır. Endometrial immün hücrelerin yüzdesi, toplam endometriyal hücrelerdeki immün hücre sayısının bölünmesiyle hesaplandı. Ticari görüntü analiz sistemi kullanılarak, konvansiyonel görüntü analizi ile analiz edilmesi zor veya imkansız olan endometriyal immün hücrelerin kantitatif değerlendirmesi kolay ve doğru bir şekilde analiz edilebilmektedir. Bu metodoloji, bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşim ve farklı üreme yetmezliği hastaları için heterojenliği dahil olmak üzere endometriyum mikro çevresini kantitatif olarak karakterize etmek için uygulanabilir. Endometriyal immün hücrelerin kantitatif değerlendirilmesi platformu, RM hastalarının tanı ve tedavisi için önemli klinik öneme sahip olabilir.

Introduction

Tekrarlayan düşük (RM), iki veya daha fazla ardışık gebeliğin kaybıdır ve son yıllarda klinisyenlerin dikkatini çeken kompleks bir hastalıktır. Doğurganlık çağındaki kadınlarda RM görülme oranı %1-%5’tir 1. Önceki çalışmaların sonuçları, immün faktörlerin RM 2,3,4,5 patogenezi ile yakından ilişkili olduğunu göstermektedir. Embriyo implantasyonu ve gelişimi için maternal-fetal arayüzde immün homeostazın sürdürülmesi gereklidir. Endometriyal bağışıklık hücreleri, bu homeostazı sürdürmek için trofoblast istilasını teşvik etmek, spiral arterleri yeniden şekillendirmek ve plasenta gelişimine katkıda bulunmak gibi çeşitli düzenleyici roller üstlenir 6,7,8,9.

RM’li kadınlarda anormal endometriyal immün hücreler daha önce bildirilmiştir. Sonuçlar, uterus doğal öldürücü hücrelerin (uNK’ler) yüksek yoğunluğu ile RM10,11,12 oluşumu arasında yakın bir ilişki olduğunu göstermektedir. RM’li kadınların endometriyumunda, canlı doğum yapanlara kıyasla artmış sayıda makrofaj bildirilmiştir13. Regülatör T hücreleri (Treg), embriyoya karşı maternal immün toleransta rol oynar ve RM hastalarının desiduasında seviyeleri ve işlevleri azalır14. Sitotoksisite T hücreleri (CTL) ve dendritik hücreler (DC’ler) de gebeliğin immün regülasyonunda rol oynar15,16. Bu nedenle, orta luteal faz sırasında lokal endometriyal immün hücrelerin kapsamlı bir kantitatif analizi, RM’nin patogenezinin daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir. Endometriyal immün hücrelerin kantitatif analizi için bazı mevcut yöntemler, immün hücreleri çoklu belirteçlerle doğru bir şekilde etiketleyebilen akış sitometrisini kullanır17,18. Bununla birlikte, akım sitometrisinin klinik uygulaması sınırlıdır, çünkü sadece taze dokuda yapılabilir. Taze doku elde etmek ancak endometriyum için nadir görülen büyük miktarda fazla tümör mevcut olduğunda mümkündür. İmmünohistokimya, doku morfolojisini yerinde iyi gözlemleyebilir ve ayrıca çeşitli bağışıklık hücrelerini etiketleyebilirken, geleneksel immünohistokimyasal teknikler bağışıklık hücrelerinin kantitatif analizini gerçekleştiremez.

Konvansiyonel immünohistokimya deneyleri ile karşılaştırıldığında, endometriyumdaki immün hücrelerin kantitatif immünohistokimyasal analizi önemli klinik öneme sahiptir. IHC yoğunluk skorlaması genellikle dört puanlık bir ölçekte veya patolojik tanı ve araştırmalarda güçlü ve zayıf olarak sıralanır 19,20,21. Bununla birlikte, bu yarı nicel teknik özneldir, oldukça yanlıştır ve önemli gözlemci içi ve gözlemciler arası değişkenlik gösterir22. Olası bir çözüm, değerli olan makine öğreniminin uygulanmasıdır.dijital görüntü analizi23,24. Bu yaklaşım, kantitatif ölçümler sağlayarak, uterus dokusu içindeki bağışıklık hücresi infiltrasyonunun, dağılımının ve yoğunluğunun daha kesin bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu nicel bilgi, menstrüel siklus sırasında ve çeşitli patolojik durumlarda bağışıklık hücresi popülasyonlarındaki dinamik değişiklikleri aydınlatmaya yardımcı olabilir. Genel olarak, endometriyumdaki bağışıklık hücrelerini immünohistokimya yoluyla kantitatif olarak analiz etme yeteneği, uterusun bağışıklık mikroçevresi hakkında değerli bilgiler sunar.

Bu nedenle, protokol, RM hastalarında orta luteal faz sırasında uNK hücreleri, Treg’ler, makrofajlar, DC’ler ve sitotoksik T hücreleri dahil olmak üzere endometriyal immün hücreleri kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu geliştirmeyi ve doğrulamayı amaçladı.

Protocol

Araştırma içeriği ve protokolü, Shenzhen Zhongshan Üroloji Hastanesi araştırma etik komitesi tarafından etik olarak gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Çalışmaya katılan tüm kadınlar (20-40 yaş) numune toplama ve kullanım için bilgilendirilmiş onam verdi. 1. Patolojik doku kazanımı Doku toplama için ölçme cetveli, cımbız, gömme kaseti, gömme kağıdı ve kağıt mendil sepeti gibi araçları hazırlayın. Pipelle kateteri i…

Representative Results

Endometrial immün hücrelerin kantitatif olarak değerlendirilmesi ve insan kaynaklı operasyonel hataların neden olduğu kararsızlığın azaltılması için otomatik immünohistokimyasal tespit ve dijital kantitatif değerlendirme sistemi kullanılarak endometrial immün hücreler için dijital kantitatif analiz platformu kuruldu. İmmünohistokimya görüntü analiz platformu, tekrarlayan düşük (RM) olan hastaların endometriyal immün hücrelerini implantasyon penceresinde kantitatif olarak analiz etmek için k…

Discussion

Bu protokol, RM hastalarının endometriyal immün hücrelerini kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu oluşturmuştur. Burada, RM hastalarında endometriyal immün mikroçevreyi değerlendirmek için altı endometriyal immün belirteç tespit edildi.

Orta luteal fazda alıcı bir endometriyum, başarılı implantasyon ve hamilelik için anahtardır27,28. Bu nedenle, endometriyal …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, bu çalışma için rıza gösteren ve örnek bağışlayan tüm kadınlara minnettardır.

Materials

Automated coverslipper Sakuraus DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163 GrowGn Biotechnology NCL-L-CD163
CD1a Gene Tech GM357129
CD56 Gene Tech GT200529
CD8 Novocastra NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator Thermo Fisher Excelsior ES
Digital pathology and Indica labs HALO
Foxp3 YILIFANG biological 14-477-82
IHC stainer Leica BOND III
Image analysis platform Indica labs HALO
Slide Scanner Olympus life science VS200
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
  2. Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. Recurrent pregnancy loss. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).
  3. Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
  4. Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
  5. Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
  6. Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
  7. Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
  8. Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
  9. Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
  10. Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
  11. Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
  12. Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
  13. Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
  14. Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).
  15. Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
  16. Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).
  17. Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
  18. Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).
  19. Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
  20. Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
  21. Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
  22. Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
  23. Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
  24. Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
  25. Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
  26. Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
  27. Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
  28. Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
  29. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
  30. Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
  31. Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
  32. Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
  33. O’Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).
  34. Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).

Tags

ImmunohistochemistryDigital Image AnalysisEndometrial Immune CellsRecurrent MiscarriageUNK CellsTregsM2 MacrophagesDCsT CellsQuantitative EvaluationEndometrium Microenvironment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chen, C., Huang, C., Wu, Y., Li, Z., Yu, S., Chen, X., Lian, R., Lin, R., Diao, L., Zeng, Y., Li, Y. Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. J. Vis. Exp. (200), e65643, doi:10.3791/65643 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image