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Biochemistry

मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्प्शन/आयनीकरण-इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए हार्ड पाम बीज तैयार करना

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65650
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, *1,2, 3, 3, 1,2
1Laboratório de Biocatálise (LABIC), Instituto Nacional de Tecnologia, 2Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य MALDI-IMS विश्लेषण के लिए कम पानी की सामग्री के साथ हार्ड बीज नमूना वर्गों की तैयारी पर विस्तृत मार्गदर्शन का वर्णन करना है, विश्लेषणों के मूल वितरण और बहुतायत को बनाए रखना और उच्च गुणवत्ता वाले संकेत और स्थानिक संकल्प प्रदान करना।

Abstract

मैट्रिक्स सहायता प्राप्त लेजर desorption/आयनीकरण-इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-IMS) उनके मूल वातावरण में यौगिकों की पहचान करने के लिए लागू किया जाता है. वर्तमान में, MALDI-IMS अक्सर नैदानिक विश्लेषण में प्रयोग किया जाता है. फिर भी, पौधे के ऊतकों में रासायनिक यौगिकों की शारीरिक जानकारी को समझने के लिए इस तकनीक को बेहतर ढंग से लागू करने के लिए एक उत्कृष्ट परिप्रेक्ष्य मौजूद है। हालांकि, तैयारी वनस्पति सामग्री से विशिष्ट नमूनों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, के रूप में MALDI-आईएमएस उचित डेटा अधिग्रहण और सफल विश्लेषण के लिए पतली स्लाइस (12-20 माइक्रोन) की आवश्यकता है. इस अर्थ में, पहले, हम Euterpe oleracea (açaí हथेली) हार्ड बीज के पतले वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल विकसित, MALDI-आईएमएस द्वारा उनके आणविक मानचित्रण को सक्षम.

यहां, हम दिखाते हैं कि विकसित प्रोटोकॉल एक ही जीनस से अन्य बीज तैयार करने के लिए उपयुक्त है। संक्षेप में, प्रोटोकॉल 24 घंटे के लिए विआयनीकृत पानी में बीज को डुबोने, जिलेटिन के साथ नमूनों को एम्बेड करने और उन्हें एक अनुकूलित क्रायोस्टेट में विभाजित करने पर आधारित था। फिर, मैट्रिक्स जमाव के लिए, एक xy गति मंच एक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) सुई स्प्रे के लिए एक 1:1 (वी / वी) 2,5-dihydroxybenzoic एसिड (डीएचबी) और 30 मिलीग्राम / एमएल पर 0.1% trifluoroacetic एसिड के साथ मेथनॉल समाधान का उपयोग करने के लिए युग्मित किया गया था. ई. precatoria और ई. edulis बीज डेटा उनके metabolite पैटर्न नक्शा करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर संसाधित किया गया.

हेक्सोज ऑलिगोमर्स को उन नमूनों के लिए प्रोटोकॉल की पर्याप्तता साबित करने के लिए नमूना स्लाइस के भीतर मैप किया गया था, क्योंकि यह ज्ञात है कि उन बीजों में बड़ी मात्रा में मन्नान होते हैं, जो हेक्सोज मैनोज का एक बहुलक है। नतीजतन, हेक्सोज ओलिगोमर्स की चोटियों, जिन्हें [एम + के] + (Δ = 162 Da) के योजकों द्वारा दर्शाया गया था, की पहचान की गई थी। इस प्रकार, नमूना तैयारी प्रोटोकॉल, पहले विकसित दर्जी के लिए ई. oleracea बीज, भी दो अन्य हार्ड ताड़ के बीज के MALDI-आईएमएस विश्लेषण सक्षम. संक्षेप में, विधि वनस्पति सामग्री के मॉर्फो-एनाटॉमी और शरीर विज्ञान में अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान उपकरण का गठन कर सकती है, विशेष रूप से कट-प्रतिरोधी नमूनों से।

Introduction

मैट्रिक्स सहायता प्राप्त लेजर desorption / आयनीकरण इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-आईएमएस) दो आयामी biomolecule असाइनमेंट की अनुमति देता है कि एक शक्तिशाली विधि है, ionizable यौगिकों की अलक्षित जांच प्रदान करता है, और उनके स्थानिक वितरण, विशेष रूप से जैविक नमूने 1,2 में निर्धारित करता है. दो दशकों के लिए, इस तकनीक लिपिड, पेप्टाइड्स, कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन, अन्य चयापचयों, और इस तरह केचिकित्सीय दवाओं 3,4 के रूप में सिंथेटिक अणुओं की एक साथ पहचान और पहचान सक्षम किया है. MALDI-IMS निष्कर्षण के बिना एक ऊतक नमूना सतह में रासायनिक विश्लेषण की सुविधा, शुद्धि, जुदाई, लेबलिंग, या जैविक नमूनों के धुंधला एजेंटों. हालांकि, सफल विश्लेषण के लिए, इस तकनीक में एक महत्वपूर्ण कदम नमूना तैयार करना है, विशेष रूप से पौधों के ऊतकों में, जो पर्यावरण के अनुकूलनके कारण व्यापक जटिल अंगों के लिए विशिष्ट और संशोधित होते हैं।

अंतर्निहित संयंत्र ऊतक भौतिक रासायनिक गुणों के कारण, MALDI-आईएमएस विश्लेषण की आवश्यकताओं के अनुरूप और सेक्शनिंगतैयारी 6,7 के दौरान ऊतक के मूल आकार को संरक्षित करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल की आवश्यकता है. अपरंपरागत नमूनों के मामले में, जैसे कि बीज, स्थापित प्रोटोकॉल8 लागू नहीं होते हैं क्योंकि इन ऊतकों में कठोर सेल की दीवारें और कम पानी की सामग्री होती है, जो आसानी से अनुभाग विखंडन का कारण बन सकती है और यौगिक विस्थानीकरण9 का कारण बन सकती है।

हमारे शोध समूह ने आणविक मानचित्रण पर प्रयोगात्मक डेटा और açaí (Euterpe oleracea Mart.) बीज 10,11,12 के MALDI-IMS विश्लेषण के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रकाशित किया है, जो किराए पर लेने योग्य açaí लुगदी 13 के उत्पादन के दौरान उच्च मात्रा में उत्पन्न एक उपोत्पाद है। यह विचार açaí बीजों में विभिन्न चयापचयों के स्वस्थानी मानचित्रण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करना था, जिससे इस कृषि अपशिष्ट के संभावित उपयोगों का सुझाव देने में मदद मिली जो वर्तमान में व्यावसायिक रूप से खोजे नहीं जा रहे हैं। हालांकि, açaí बीज के प्रतिरोध के कारण, यह दर्जी MALDI-आईएमएस विश्लेषण से उचित नमूना सेक्शनिंग प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल बनाने के लिए आवश्यक था.

इस संदर्भ में, आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण एसी लुगदी ने समान संवेदी विशेषताओं वाले यूटरपे जीनस ताड़ के पेड़ों से अन्य फलों के बढ़ते व्यावसायीकरण को प्रेरित किया है। दो उभरते ताड़ के पेड़ों के फल जो औद्योगिक पैमाने पर açaí14,15 के विकल्प के रूप में उत्पादित किए गए हैं, वे हैं E. precatoria (açaí-do-amazonas के रूप में जाना जाता है), जो अमेज़ॅन ड्राईलैंड में बढ़ता है, और E. edulis (जिसे जुकारा के रूप में जाना जाता है), जो अटलांटिक वन से विशिष्ट है। फिर भी, açaí-do-amazonas और juçara की खपत से प्रतिरोधी और अखाद्य बीजों का समान संचय होता है जिनका लाभ नहीं उठाया जाता है और उनकी विस्तृत रासायनिक संरचना के बारे में अब तक अध्ययन नहीं किया गया है।

इस प्रकार, हम यहाँ प्रदर्शित करते हैं कि पहले से तैयार प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है, कुछ अनुकूलन के साथ, विश्लेषण करने के लिए ई. प्रीकेटोरिया और ई. MALDI-IMS द्वारा आणविक मानचित्रण के लिए edulis बीज, एक शक्तिशाली उपकरण साबित होता है जिसका उपयोग इन संसाधनों की संरचना के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है और उनके संभावित जैव प्रौद्योगिकी उपयोगों को निर्धारित करने में मदद कर सकता है। इसके अलावा, विस्तृत विवरण यहाँ प्रदान की MALDI आईएमएस विश्लेषण के लिए प्रतिरोधी सामग्री तैयार करने में इसी तरह की कठिनाइयों के साथ दूसरों की सहायता कर सकते हैं.

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Protocol

Euterpe precatoria के बीज कृपया Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brazil) द्वारा दान किए गए थे, और Euterpe edulis के बीज कृपया औद्योगिक depulping प्रक्रिया के बाद Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brazil) द्वारा दान किए गए थे। बीज कमरे के तापमान पर सीलबंद प्लास्टिक के बक्से में बनाए रखा गया था।

1. मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption/आयनीकरण-इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (MALDI-IMS)

  1. बीज सेक्शनिंग प्रोटोकॉल
    1. प्रत्येक प्रजाति के तीन बीजों को 24 घंटे के लिए विआयनीकृत पानी में बैठने दें।
    2. अगले दिन, क्रायोस्टेट चालू करें ( सामग्री की तालिकादेखें) और इसे -20 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने दें।
    3. गीले बीजों को पानी से बाहर निकाल लें। एक माइक्रोटोम ब्लेड का उपयोग करके बीज को आधा में काटें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    4. एक ताजा, गर्म (10%) जिलेटिन समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    5. आधे बीज को एक सांचे पर रखें और इसे ताजा बने जिलेटिन से भरें। क्रायोस्टेट पर जाने से पहले 2 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    6. एक इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी, सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके क्रायोस्टेट समर्थन के लिए एम्बेडेड बीज संलग्न करें और ओसीटी सख्त करने के लिए क्रायोस्टेट के अंदर 10 मिनट के लिए छोड़ दें।
    7. एक इंडियम टिन ऑक्साइड-लेपित ग्लास स्लाइड (आईटीओ स्लाइड; सामग्री की तालिकादेखें) में तांबा डबल-फेस चिपकने वाला टेप जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    8. प्रत्येक प्रजाति से 20 माइक्रोन मोटी वर्गों का उत्पादन और आईटीओ ग्लास स्लाइड का पालन तांबे डबल का सामना करना पड़ा चिपकने वाला टेप पर उन्हें जगह.
      नोट: इस बिंदु पर, स्लाइड पर एकत्र किए गए स्लाइस को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है; वैकल्पिक रूप से, मैट्रिक्स बयान करने के लिए आगे बढ़ें. स्लाइड्स एक धारक स्लाइड बॉक्स में रखा जाना चाहिए, गैसीय एन2 के साथ फ्लश किया जाना चाहिए, और नमूना ऑक्सीकरण ( सामग्री की तालिकादेखें) को रोकने के लिए फिल्म के साथ सील कर दिया जाना चाहिए.
  2. मैट्रिक्स जमाव
    1. एक वैक्यूम desiccator में स्लाइस युक्त स्लाइड प्लेस जब तक यह कमरे के तापमान तक पहुँच जाता है.
    2. प्रत्येक स्लाइड कोने में एक सुधार पेन का उपयोग करके शिक्षण चिह्न बनाएं। टेबल स्कैनर का उपयोग करके स्लाइड को स्कैन करें। 4,800 पीपीआई के संकल्प पर सेट करें।
    3. 2,5-डायहाइड्रॉक्सीबेन्ज़ोइक एसिड (डीएचबी; सामग्री की तालिकादेखें) के 30 मिलीग्राम वजन के लिए एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करें और 1: 1 मेथनॉल के 1 एमएल तैयार करें: 0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए; सामग्री की तालिका) डीएचबी को भंग करने का समाधान।
    4. डीएचबी समाधान के साथ 1 एमएल ग्लास सिरिंज ( सामग्री की तालिकादेखें) भरें और इसे 0.8 एमएल / घंटा की प्रवाह दर पर सेट सिरिंज पंप ( सामग्री की तालिकादेखें) में रखें।
    5. तिरछी टयूबिंग का प्रयोग, एक वायुमंडलीय दबाव रासायनिक आयनीकरण (APCI) सुई ( सामग्री की तालिका) (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए सिरिंज कनेक्ट.
    6. एन2 को एपीसीआई सुई से कनेक्ट करें और इसे 12.5 साई प्रवाह दर पर सेट करें।
    7. एपीसीआई सुई को xy गति मंच पर संलग्न करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। सुनिश्चित करें कि एपीसीआई सुई की नोक स्लाइड से 4 सेमी ऊपर है।
    8. ड्राइंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना ( सामग्री की तालिका और पूरक चित्र 1 देखें), टेम्पलेट का पालन करने के लिए xy गति मंच सेट करें। टेम्पलेट में क्षैतिज समानांतर रेखाएं होती हैं जो 1 मिमी की दूरी पर होती हैं।
    9. मैट्रिक्स बयान प्राप्त करने के लिए, टेम्पलेट 20 बार दोहराने के लिए xy गति मंच के लिए प्रतीक्षा करें.
      चेतावनी: मैट्रिक्स बयान एक रासायनिक धूआं हुड में किया जाना चाहिए.
  3. इमेजिंग अधिग्रहण
    1. मास स्पेक्ट्रोमीटर में स्लाइड रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. संदर्भित सॉफ़्टवेयर पर शिक्षण बिंदु सेट करने के लिए सुधार कलम चिह्नों का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. लेजर पावर (60%), लेजर फोकस (मध्यम), शॉट्स की संख्या (100), और सॉफ्टवेयर में ध्रुवीयता सेट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। 99% डेटा कमी कारक सेट करें और FID फ़ाइल को पश्च डेटा अंशांकन के लिए सहेजें। विधि सहेजें।
    4. मास स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर से बहुभुज माप क्षेत्र उपकरण जोड़ें का उपयोग करके विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्र का परिसीमन करें। माप क्षेत्र मापदंडों को संपादित करें जो पिछले चरण में सहेजी गई विधि और रेखापुंज चौड़ाई को 100 माइक्रोन (पूरक चित्रा एस 4 ए) में इंगित करता है।
    5. इमेजिंग अधिग्रहण शुरू करें।
  4. डेटा विश्लेषण
    1. अंशशोधक टैब (अनुपूरक चित्रा S4B) में संदर्भित सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) में एक बड़े पैमाने पर सूची बनाने के लिए मैट्रिक्स क्लस्टर और ज्ञात दूषित पदार्थों का उपयोग करें।
      1. संदर्भित सॉफ़्टवेयर में कैलिब्रेट किए जाने वाले डेटा को खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें)। अंशांकन टैब में, बड़े पैमाने पर बनाया सूची खोलने के लिए और राइट क्लिक करके एक संवाद बॉक्स खोलने के लिए और सेट लॉक जनता विकल्प (पूरक चित्रा S4C) चुनें.
      2. 0.5 गाऊसी चौड़ा और 3.5 लाइन चौड़ा करने के साथ गाऊसी खिड़की मोड का चयन करें. ऑनलाइन अंशांकन अनियंत्रित छोड़ दें। मोड (सिंगल), थ्रेसहोल्ड (1,000), और मास टॉलरेंस (5 पीपीएम) का चयन करें। प्रक्रिया के साथ डेटा को कैलिब्रेट करें और 2 डी डेटा टूल (पूरक चित्रा एस 4 सी) को बचाएं।
    2. अंशांकन के बाद, डेटा को SCiLS लैब या अन्य संगत सॉफ़्टवेयर में निर्यात करें और वांछित m/z मान सीमा (चुनी गई सीमा: 150 से 2,500) सेट करें।
      नोट:: फ़ाइल आकार या कंप्यूटर की विशेषताओं के आधार पर, यह कुछ समय लग सकता है।
    3. कुल आयन गणना (टीआईसी) या रूट माध्य वर्ग (आरएमएस) के बीच एक सामान्यीकरण विधि चुनें।
      नोट: इस विश्लेषण के लिए, टीआईसी को चुना गया था।
    4. यदि मैप किए जाने वाले विश्लेषणों को जाना जाता है, तो प्रत्येक विश्लेषण के लिए प्रत्येक एम / जेड मान को प्लॉट करें और उत्पन्न छवियों और वर्णक्रमीय औसत प्लॉट को बचाएं।
      नोट: इस काम में, हेक्सोज ओलिगोमर्स से एम / जेड मूल्यों को पोटेशियम एडिक्ट पर विचार करके चुना गया था।

2. ऊर्जा-फैलाने वाली स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईडीएस)

  1. बीज सेक्शनिंग प्रोटोकॉल
    1. एक सेक्शनिंग आरा मशीन में एक पतली बीज टुकड़ा प्राप्त करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. निम्नलिखित मापदंडों के साथ बीज काटें: 500 आरपीएम काटने की गति, 100 एन लोड चार्ज, और 15 एचसी डायमंड वेफरिंग ब्लेड ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: गोनियोमीटर से जुड़ी सटीक विज़ में पकड़ के लिए आवश्यक आसंजन के कारण बीज से फाइबर के मैनुअल हटाने को संभालें। उपयोग करने से पहले ब्लेड को साफ करें, विश्लेषण के दौरान अवांछनीय खनिजों को जोड़ने से रोकने के लिए बीज के एक हिस्से को काट लें।
    3. कट से सभी कण अवशेषों को हटाने के लिए संपीड़ित हवा के साथ नमूनों को साफ़ करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    4. समर्थन में कार्बन दो तरफा प्रवाहकीय टेप ( सामग्री की तालिकादेखें) में एक बीज अनुभाग को ठीक करें।
  2. विश्लेषण की स्थिति
    1. ईडीएस के साथ मिलकर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) के वैक्यूम कक्ष के अंदर एक बीज अनुभाग के साथ समर्थन संलग्न करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. 20 केवी त्वरण और 4.0 के स्पॉट आकार के साथ एक मॉडल माइक्रोस्कोप पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्राप्त करें, माध्यमिक इलेक्ट्रॉन संकेतों (सामग्री की तालिकादेखें), बैकस्कैटर्ड इलेक्ट्रॉनों (ध्रुवीय टुकड़े पर तय ठोस राज्य डिटेक्टर), और इन दो प्रकार के संकेतों के मिश्रण (एमआईएक्स), कृत्रिम रूप से रंगीन छवियों का निर्माण।
    3. ईडीएस स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण के लिए, उपरोक्त एसईएम के साथ युग्मित स्पेक्ट्रोमीटर ( सामग्री की तालिका) का उपयोग करें। ईडीएस से छवि अधिग्रहण की स्थिति विन्यास एसईएम के समान है।
    4. झुकाव डिग्री, ऊंचाई, और दिगंश को क्रमशः 0.0, 35.0 और 0.0 पर सेट करें।
  3. डेटा अधिग्रहण
    1. डेटा प्राप्त करने के लिए बीज अनुभाग के 91x आवर्धन के साथ तीन अलग-अलग क्षेत्रों को सेट करें।
    2. अधिग्रहण की समाप्ति पर या अधिग्रहण के दौरान स्पेक्ट्रम में चोटियों की पहचान करें। चोटियों को मैन्युअल रूप से पहचानने के लिए तत्वों की पुष्टि करें चरण बटन का उपयोग करें।
    3. प्रत्येक चयनित क्षेत्र के लिए अधिग्रहण का समय 60 सेकंड पर सेट करें। प्रक्रिया का समय पांच पर सेट करें; पैरामीटर एक से छह की प्रक्रिया समय के लिए उपलब्ध हैं।
      नोट: तत्वों के संकेत स्थिर हैं और जोड़ते हैं, जबकि शोर यादृच्छिक और हानिकारक होते हैं। प्रसंस्करण समय जितना लंबा होगा, शोर उतना ही कम होगा।
    4. महत्वपूर्ण मात्रात्मक परिणाम प्रदर्शित करने के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स दो सिग्मा (मानक विचलन) से ऊपर हैं। अवांछनीय परिणामों को कम करने के लिए दो सिग्मा को शून्य पर सेट करें।
    5. तत्वों की प्रत्येक तीव्रता को सामान्य करें; यह सॉफ्टवेयर में एक मानकीकृत पैरामीटर है ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    6. डेटा का विश्लेषण करने के लिए, इसे DOC फ़ाइल में निर्यात करें।
  4. डेटा विश्लेषण
    1. मात्रात्मक मौलिक विश्लेषण के लिए शिखर तीव्रता का सटीक माप सुनिश्चित करें।
    2. ओवरलैपिंग चोटियों को बेहतर शिखर पृथक्करण के लिए विघटन की आवश्यकता होती है; आवश्यकता पड़ने पर शोर पृष्ठभूमि घटाएं।
    3. जब कोई अतिव्यापी नहीं होता है, तो संकेतों को बढ़ाने और स्पेक्ट्रम की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए लाभ बढ़ाएं।

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Representative Results

तैयार प्रोटोकॉल सक्षम ई . precatoria और ई. edulis बीज के MALDI-IMS विश्लेषण. नतीजतन, हम आंशिक संरचनात्मक स्पष्टीकरण के रूप में कार्बोहाइड्रेट के आणविक भार और पोलीमराइजेशन (डीपी) की डिग्री की पुष्टि कर सकते हैं। MALDI-आईएमएस विश्लेषण (चित्रा 1 और चित्रा 2) द्वारा प्रदान की आणविक जानकारी मैट्रिक्स के लिए नमक जोड़ने के बिना हेक्सोज oligomers (Δ = 162 दा) के [एम + कश्मीर] + adducts का प्रतिनिधित्व चोटियों का प्रदर्शन किया. हेक्सोज डिमर (एम/जेड 381), ट्रिमर (एम/जेड 543), टेट्रामर्स (एम/जेड 705), पेंटामर्स (एम/जेड 867), हेक्सामर्स (एम/जेड 1029), और 14-यूनिट ओलिगोमर्स (एम/जेड 2325) तक दोनों बीज ऊतकों में पहचाने गए। दोनों नमूनों (चित्रा 3) के लिए बॉक्स भूखंडों बीज एंडोस्पर्म में पाए जाने वाले प्रत्येक हेक्सोज ओलिगोमर की चरम तीव्रता को इंगित करते हैं, उनके वितरण और उच्च डीपी ओलिगोमर्स की थोड़ी अधिक सामग्री का प्रदर्शन करते हैं।

इससे पहले, हम ई. oleracea बीज, जो संकेत दिया है कि MALDI-आईएमएस विश्लेषण में पता चला पोटेशियम adducts ऊंचा पोटेशियम सामग्री10 के नमूना की आंतरिक विशेषता के कारण थे पर ईडीएस डेटा प्रदान की. इस अध्ययन ने नमूना के वर्गों (अनुपूरक चित्रा एस 2 और पूरक चित्रा एस 3) में मुख्य तत्वों की पहचान करने के लिए ई. प्रीकेटोरिया और ई. एडुलिस बीजों का भी विश्लेषण किया। ऊतक की सतह पर देखी गई परमाणु संरचना को सजातीय रूप से वितरित किया गया था, जिसमें मुख्य रूप से गैर-खनिज तत्व, जैसे कार्बन और ऑक्सीजन, और कम खनिज सामग्री दिखाई देती थी। दोनों नमूनों में, पोटेशियम ईडीएस विश्लेषण (पूरक चित्रा एस 2 और पूरक चित्रा एस 3) द्वारा पाया गया मुख्य खनिज तत्व था।

Figure 1
चित्रा 1: सकारात्मक मोड में MALDI-IMS द्वारा Euterpe precatoria बीज में Hexose oligomer वितरण. (ए) मास स्पेक्ट्रम प्राप्त. (बी) हिस्टोलॉजिकल छवि और MALDI-IMS विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया फ्रेम. (सी-ओ) एक विशिष्ट एम/जेड सिग्नल की छवि प्रतिनिधित्व प्रत्येक [एम + के] + हेक्सोज डिमर (सी), ट्रिमर (डी) से ऊतक में इसकी तीव्रता का वर्णन करती है, बीज के एंडोस्पर्म में 14 इकाइयों (ई-ओ) तक। स्केल बार = 4 मिमी (बी)। संक्षिप्तीकरण: MALDI-IMS = मैट्रिक्स सहायता प्राप्त लेजर desorption/ionization-इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सकारात्मक मोड में MALDI-IMS द्वारा Euterpe edulis बीज में हेक्सोज oligomer वितरण. (ए) मास स्पेक्ट्रम प्राप्त. (बी) हिस्टोलॉजिकल छवि और MALDI-IMS विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया फ्रेम. (सी-ओ) एक विशिष्ट एम/जेड सिग्नल की छवि प्रतिनिधित्व प्रत्येक [एम + के] + हेक्सोज डिमर (सी), ट्रिमर (डी) से ऊतक में इसकी तीव्रता का वर्णन करती है, बीज के एंडोस्पर्म में 14 इकाइयों (ई-ओ) तक। स्केल बार = 5 मिमी (बी)। संक्षिप्तीकरण: MALDI-IMS = मैट्रिक्स सहायता प्राप्त लेजर desorption/ionization-इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बॉक्स प्लॉट विज़ुअलाइज़ेशन। (ए) ई. प्रीकेटोरिया और (बी) ई. एडुलिस, बीज ऊतक में पाए जाने वाले प्रत्येक हेक्सोज ओलिगोमर की चोटी की तीव्रता और वितरण का संकेत देता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा एस 1: मैट्रिक्स कोटिंग टेम्पलेट। डीएचबी मैट्रिक्स को 75 मिमी द्वारा दूरी पर क्षैतिज समानांतर रेखाओं की 25 मिमी x 1 मिमी स्लाइड पर समान वितरण के लिए ड्राइंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्लेटफॉर्म पर छिड़का गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा एस 2: ऊर्जा फैलाने वाले एक्स-रे स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा ई. प्रीकेटोरिया बीजों का प्राथमिक संरचना विश्लेषण। (ए) ई. प्रीकेटोरिया बीज नमूना सतह अनुभाग। (बी) प्रमुख तत्व अर्ध-मात्रित। मुख्य घटक लगभग 47.0% कार्बन (C), 52.7% ऑक्सीजन (O), और 0.2% पोटेशियम (K) के अनुरूप हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा एस 3: ऊर्जा फैलाने वाले एक्स-रे स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा ई. एडुलिस बीज का प्राथमिक संरचना विश्लेषण। (ए) ई. edulis नमूना सतह अनुभाग। (बी) प्रमुख तत्व अर्ध-मात्रित। मुख्य घटक लगभग 47.7% कार्बन (C), 53.8% ऑक्सीजन (O), 0.3% पोटेशियम (K), और क्लोरीन (Cl) के कुछ निशान के अनुरूप हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र S4: एक छवि और डेटा विश्लेषण में क्षेत्र का परिसीमन। (ए) विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्र का परिसीमन और मापदंडों और रेखापुंज चौड़ाई को 100 माइक्रोन तक संपादित करना। (बी) एक मैट्रिक्स क्लस्टर की पहचान और एक जन सूची का निर्माण। (सी) डेटा का अंशांकन और 2 डी डेटा टूल को सहेजना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पौधे विशिष्ट जैव रासायनिक कार्यों के लिए विशेष ऊतकों से बने होते हैं। इसलिए, MALDI-आईएमएस के लिए नमूना तैयार प्रोटोकॉल विशिष्ट physicochemical गुणों के साथ विभिन्न संयंत्र ऊतकों के अनुसार डिजाइन किया जाना चाहिए, के रूप में नमूने उनके मूल विश्लेषण वितरण और उच्च गुणवत्ता वाले संकेत और स्थानिक संकल्प8 के लिए बहुतायत बनाए रखना चाहिए.

MALDI-आईएमएस विश्लेषण से पहले, प्राथमिक विचार एकत्र करने और ठीक से नमूने भंडारण है. हालांकि, पौधों में, नमूना तैयार करना अक्सर विश्लेषण किए गए ऊतक के आधार पर भिन्न होता है। उदाहरण के लिए, सेल दीवार lignification और संयंत्र के ऊतकों में पानी की सामग्री नमूना7 में आकृति विज्ञान का एक सटीक प्रतिनिधित्व बनाए रखने के लिए सेक्शनिंग के दौरान चुनौतियों का सामना कर सकते हैं.

MALDI-आईएमएस विश्लेषण ऊतक तैयारी और सेक्शनिंग, मैट्रिक्स कोटिंग, और डेटा विश्लेषण से मिलकर एक कार्यप्रवाह में विभाजित किया जा सकता है. हालांकि, इमेजिंग परिणामों की गुणवत्ता और प्रामाणिकता सीधे नमूना तैयार करने की विधि से प्रभावित होती है, जो एक महत्वपूर्ण कदम है। इस अध्ययन में इस्तेमाल नमूना तैयारी विधि ई oleracea परिपक्व बीज10 के लिए एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल पर आधारित था. अन्य नमूनों के लिए सेक्शनिंग प्रोटोकॉल को मान्य करने के लिए, हमने पतली (20 माइक्रोन) वर्गों को प्राप्त करने और उचित संकल्प के साथ MALDI-IMS विश्लेषण को सक्षम करने के लिए E. precatoria और E. edulis बीजों का उपयोग करके नमूना सेक्शनिंग के चरणों का मूल्यांकन किया। अधिकांश जानकारी प्रोटोकॉल अनुभाग में विस्तार से वर्णित है; हालांकि, हम जोर देते हैं कि मैनुअल बाहरी फाइबर परत हटाने बीज नरम करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, ब्लेड सेक्शनिंग की अनुमति.

मानक हिस्टोलॉजिकल वर्कफ़्लोज़ आमतौर पर MALDI-IMS के लिए हतोत्साहित कर रहे हैं, के बाद से निर्धारण प्रक्रियाओं आयन दमन प्रभाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. क्रायोसेक्शनिंग नमूना तैयार करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि है। हालांकि, नमूना संकोचन या ढहते हो सकता है, मेटाबोलाइट अव्यवस्था प्रदान करने और जैविक व्याख्या 5,8 बाधा. पत्तियों और फूलों जैसे नरम ऊतकों के लिए एक और संभावना छाप विधि है। हालांकि, इस अध्ययन के लिए, नमूनों में कठोर ऊतक प्रकृति और कम पानी की सामग्री के कारण, सेक्शनिंग से पहले इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक सटीक, उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक वर्गों को प्रदान करने के लिए विशिष्ट सामग्री के साथ नमूना एम्बेड करना था।

यह उल्लेखनीय है कि ऊतक मोटाई एक कम संकेत तीव्रता के लिए नेतृत्व कर सकता है. कुल मिलाकर, MALDI-IMS पर्याप्त संकल्प प्रदान करने के लिए एक <20 माइक्रोन टुकड़ा मोटाई की आवश्यकता है. हालांकि, कठोर और बड़े पौधे के ऊतक आमतौर पर एक पतले नमूने के सेक्शनिंग के दौरान फ्रैक्चर करते हैं। इस समस्या को हल करने के लिए, प्रोटोकॉल ने तांबे16 से बने एक प्रवाहकीय चिपकने वाला टेप का उपयोग किया, वर्गों के विरूपण को कम किया और स्लाइड को लगाव की सुविधा प्रदान की। इसके अलावा, पूरे बीज का एक पतला खंड प्राप्त करना रात भर विआयनीकृत पानी में भिगोए बिना मुश्किल है। हालांकि, इस समय के लिए नमूना एम्बेड करने से मेटाबोलाइट अव्यवस्था हो सकती है; इसलिए, ई. oleracea बीज11 के साथ पहले से प्रकाशित एक अध्ययन में, हम छोटे वर्गों की तुलना में (गीला और सूखा) के साथ और भिगोने कदम, जिसमें से परिणाम बीज tegument में पाया procyanidins के लिए कोई अव्यवस्था का संकेत दिया.

मैट्रिक्स जमाव ऊतक अनुभाग सतह पर मैट्रिक्स समरूपता के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है, विश्लेषण आयनीकरण सुनिश्चित करना। MALDI मैट्रिक्स बयान के लिए, हम प्रारंभिक परीक्षणों में, इस तरह के 9-aminoacridine (9AA), α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (एचसीसीए), 1,5-diaminonapthalene (दान), और 2,5-dihydroxybenzoic एसिड (DHB) के रूप में विभिन्न matrices का मूल्यांकन किया. डीएचबी को मैट्रिक्स के रूप में चुना गया था क्योंकि यह कार्बोहाइड्रेट संकेतों (डेटा नहीं दिखाया गया) पर बेहतर रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है और इसकी "सार्वभौमिक विश्लेषण" प्रकृति1 के कारण भी; हालांकि, मूल विधि ने एक उच्च बनाने की क्रिया दृष्टिकोण10,17 को नियोजित किया, जबकि इस बार हमने मैट्रिक्स कोटिंग की स्थिति को नियंत्रित करने और उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि के लिए और आयन दमन प्रभाव से बचने के लिए अधिक समान अनुप्रयोग और छोटे मैट्रिक्स क्रिस्टल प्रदान करने के लिए स्वचालित रोबोट छिड़काव का उपयोग किया।

ई. precatoria और ई. edulis एक पतली बाहरी tegument द्वारा कवर स्वैच्छिक सजातीय endosperm के साथ ग्लोबोज के आकार का बीज प्रदर्शन, केवल अपनी विशेषता ruminated endosperm 10,18,19 की वजह से ई. oleracea बीज से अलग है. इन संयंत्र के नमूनों के लिए पाया अपरंपरागत natures अनुकूलित सेक्शनिंग और मैट्रिक्स बयान प्रोटोकॉल के लिए इसी तरह प्रसंस्करण कठिनाइयों प्रदान की. हालांकि, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि नमूना तैयार करना पर्याप्त था और विश्वसनीय और प्रभावी छवियां प्रदान की गईं, जिसने ई. प्रीकेटोरिया और ई. एडुलिस बीजों में चयापचयों के स्थानिक स्थानीयकरण को निर्धारित किया। MALDI-IMS विश्लेषण उनके आणविक मानचित्रण डेटा के आधार पर साहित्य में पहली बार के लिए इन कच्चे माल के संभावित शोषण सक्षम.

ईडीएस डेटा ने विश्लेषण किए गए बीज ऊतकों में 1% से कम पोटेशियम की उपस्थिति का संकेत दिया ई. एडुलिस और ई. प्रीकेटोरिया. हालांकि, एकाग्रता MALDI-आईएमएस विश्लेषण के दौरान [एम + के] + चोटियों प्रदान करने के लिए काफी अधिक था. पहले प्रकाशित अध्ययनों ने पोटेशियम कोदोनों बीजों 20,21 में पाए जाने वाले मुख्य खनिज के रूप में पहचाना था, जो यूटरपे जीनस के बीज में पोटेशियम की प्राकृतिक उपस्थिति का संकेत देता है और इन प्रजातियों के माल्डी-आईएमएस डेटा में एडिक्ट्स की व्याख्या करता है।

इस अध्ययन में, हमने अवधारणा के प्रमाण का भी मूल्यांकन किया कि ई. ओलेरासिया बीज के लिए तैयार प्रोटोकॉल ई. प्रीकेटोरिया और ई. एडुलिस बीज के लिए लागू किया गया था। आरक्षित polysaccharide açaí (ई. oleracea) बीज के endosperm में पाया प्रमुख मन्नान22, जिसका संगठन अत्यधिक क्रिस्टलीय है, endosperm कठोरता बढ़ाने परिपक्व बीज10,19 के पतले वर्गों को प्राप्त करने के लिए है. पिछले अध्ययनों ने ग्रेविमेट्रिक विधियों द्वारा दोनों बीजों के एंडोस्पर्म में कार्बोहाइड्रेट की मात्रा निर्धारित की, बीज के सूखे वजन20,21के 90% से ऊपर की सामग्री का पता लगाया। इसके अलावा, ई. edulis में एक हिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन ध्रुवीकृत प्रकाश18 के तहत अपने अत्यधिक क्रिस्टलीय और मजबूत birefringence के माध्यम से endosperm में mannan की उपस्थिति का सुझाव दिया. फिर भी, दोनों बीजों के एंडोस्पर्म में आरक्षित कार्बोहाइड्रेट की रासायनिक संरचना पर कोई डेटा नहीं है। ई. oleracea बीज के लिए उनके phylogenetic निकटता की वजह से, MALDI-IMS द्वारा पहचान hexose oligomers भी mannan-oligosaccharides होने की उम्मीद कर रहे हैं. फिर भी, भविष्य के अध्ययनों की आवश्यकता है जो इन आरक्षित पॉलीसेकेराइड की रासायनिक संरचना का मूल्यांकन करते हैं ताकि ई. प्रीकेटोरिया और ई. एडुलिस बीजों में मन्नान और मन्नान-ओलिगोसेकेराइड संरचनाओं की पुष्टि की जा सके।

इस प्रोटोकॉल को उन बीजों के अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण के रूप में लागू किया जा सकता है, जो यहां हमारे वर्णित लक्ष्य से परे हैं। उदाहरण के लिए, यह तकनीक बीज विकास और अंकुरण के दौरान जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के विश्लेषण को लाभान्वित कर सकती है। अंत में, विस्तृत विवरण यहाँ प्रदान की पौधों से अन्य प्रतिरोधी सामग्री के MALDI आईएमएस द्वारा विश्लेषण के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल तैयार करने के लिए एक उपयोगी प्रारंभिक बिंदु हो सकता है.

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को Serrapilheira Institute (Serra-1708-15009), और कार्लोस चगास फिल्हो फाउंडेशन फॉर सपोर्टिंग रिसर्च इन द स्टेट ऑफ रियो डी जनेरियो (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021) द्वारा वित्तपोषित किया गया था। सेरापिलहेरा इंस्टीट्यूट और नेशनल काउंसिल फॉर साइंटिफिक एंड टेक्नोलॉजिकल डेवलपमेंट (CNPq) ने डॉ. फेलिप लोप्स ब्रूम और डॉ. गेब्रियल आर. मार्टिंस (संस्थागत क्षमता निर्माण कार्यक्रम/INT/MCTI) के लिए छात्रवृत्ति प्रदान की। उच्च शिक्षा कार्मिक (सीएपीईएस) के सुधार के लिए समन्वय को श्री डेवी एमसी दा सिल्वा के लिए मास्टर छात्रवृत्ति प्रदान करने के लिए स्वीकार किया जाता है। Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) को MALDI-IMS विश्लेषण के साथ प्रदान की गई सेवाओं के लिए मान्यता प्राप्त है, और श्री एलन मेनेजेस डो Nascimento और Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ अनुदान Nº 442604/2019 द्वारा वित्त पोषित, प्राथमिक रचना विश्लेषण के लिए धन्यवाद दिया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock Hamilton Company 81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid Sigma Aldrich Co, MO, USA 149357
APCI needle Bruker Daltonik, Bremen, Germany 602193
AxiDraw V3 xy motion platform Evil Mad Scientist, CA, USA 2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software  creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape 3M, USA 1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging Bruker Daltonik, Bremen, Germany image acquisition
FTMS Processing Bruker Daltonik, Bremen, Germany data calibration
Gelatin from bovine skin Sigma Aldrich Co, MO, USA G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818 Leica  Biosystems, Nussloch, Germany 0358 38926
indium tin oxide coated glass slide Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8237001
Inkscape Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter Buehler, Illinois, USA
Methanol J.T.Baker 9093-03
Mili-Q water 18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound Fisher HealthCare, Texas, USA 4585
Parafilm "M" Sealing Film Amcor HS234526B
Quanta 450 FEG FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software  Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump kdScientific, MA, USA 78-9100K
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich Co, MO, USA 302031
X-Max spectrometer Oxford Instruments, Ableton, UK

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References

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जैव रसायन अंक 196 नमूना तैयार करना वानस्पतिक सामग्री पतली स्लाइस यूटरपे ओलेरासिया आणविक मानचित्रण बीज जिलेटिन एम्बेडिंग क्रायोस्टेट सेक्शनिंग मैट्रिक्स जमाव इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण 2,5-डायहाइड्रॉक्सीबेंजोइक एसिड मेथनॉल समाधान ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड ई।
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