Détermination de l’activité procoagulante de la vésicule extracellulaire (EV) à l’aide du temps de coagulation activé par EV (EV-ACT)

Summary

Ce protocole étudie l’utilisation d’un plasma riche en vésicules extracellulaires (VE) comme indicateur de la capacité de coagulation de l’EV. Le plasma riche en VE est obtenu par un processus de centrifugation différentielle et de recalcification ultérieure.

Abstract

Le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans diverses maladies fait l’objet d’une attention accrue, notamment en raison de leur puissante activité procoagulante. Cependant, il y a un besoin urgent d’un test au chevet du patient pour évaluer l’activité procoagulante de la VE en milieu clinique. Cette étude propose l’utilisation du temps d’activation de la thrombine du plasma riche en VE comme mesure de l’activité procoagulante des VE. Des procédures normalisées ont été utilisées pour obtenir du sang total contenant du sodium et du sang total, suivies d’une centrifugation différentielle pour obtenir du plasma riche en VE. Le plasma riche en VE et le chlorure de calcium ont été ajoutés à la coupelle d’essai, et les changements de viscoélasticité ont été surveillés en temps réel à l’aide d’un analyseur. Le temps de coagulation naturel du plasma riche en VE, APPELÉ EV-ACT, a été déterminé. Les résultats ont révélé une augmentation significative de l’EV-ACT lorsque l’EV a été retiré du plasma obtenu à partir de volontaires sains, tandis qu’elle a considérablement diminué lorsque l’EV a été enrichie. De plus, l’EV-ACT a été considérablement raccourci dans les échantillons humains de prééclampsie, de fracture de la hanche et de cancer du poumon, ce qui indique des niveaux élevés d’EV plasmatique et une promotion de l’hypercoagulation sanguine. Grâce à sa procédure simple et rapide, EV-ACT est prometteur en tant que test de chevet pour évaluer la fonction de coagulation chez les patients présentant des taux plasmatiques élevés d’EV.

Introduction

La thrombose, qui est causée par l’hypercoagulabilité, joue un rôle important dans diverses maladies, notamment les traumatismes cérébraux¹, la pré-éclampsie², les tumeurs³ et les patients fracturés⁴. Le mécanisme sous-jacent à l’hypercoagulabilité est complexe, et l’accent a récemment été mis sur le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans les troubles de la coagulation. Les VE sont des corps en forme de vésicule avec une structure bicouche qui se détache de la membrane cellulaire, dont le diamètre varie de 10 nm à 1000 nm. Ils sont associés à divers processus pathologiques, en particulier les troubles de la coagulation⁵. Plusieurs études ont identifié les VE comme un prédicteur prometteur du risque de thrombose ^6,7. L’activité procoagulante des VE dépend de l’expression des facteurs de coagulation, principalement le facteur tissulaire (TF) et la phosphatidylsérine (PS). Les VE ayant une activité procoagulante robuste améliorent considérablement l’efficacité catalytique du complexe ténase et prothrombine, favorisant ainsi le fibrinogène médié par la thrombine et la thrombose locale⁸. Des niveaux élevés de VE et leur relation causale avec l’hypercoagulabilité ont été observés dans de nombreuses maladies⁹. Par conséquent, la normalisation de la détection des VE et de la déclaration de leur activité procoagulante est un domaine d’investigation important¹⁰.

À ce jour, seuls quelques kits commerciaux sont disponibles pour détecter l’activité procoagulante des VE. Le test MP-Activity et le test MP-TF, produits par une société commerciale, sont des tests fonctionnels utilisés pour mesurer l’activité procoagulante de l’EV dans le plasma¹¹. Ces tests utilisent un principe similaire à celui des tests immuno-enzymatiques pour détecter le PS et le TF sur les VE. Cependant, ces kits sont coûteux et limités à quelques institutions de recherche de haut niveau. Le processus est complexe et prend beaucoup de temps, ce qui rend difficile leur mise en œuvre en milieu clinique. De plus, un test de phospholipides procoagulants (PPL) mis au point dans le commerce mélange du plasma sans PS avec du plasma d’essai, mesurant le temps de coagulation pour détecter quantitativement les niveaux de VE PS-positifs¹². Cependant, ces essais se concentrent principalement sur le PS et le TF sur les VE, en négligeant d’autres voies de coagulation dans lesquelles les VE circulants peuvent être impliqués dans¹².

Le système de coagulation plasmatique est complexe et comprend à la fois des composants « invisibles » et « visibles », notamment des coagulants, des anticoagulants, des systèmes fibrinolytiques et des VE en suspension dans le plasma. Physiologiquement, ces composants maintiennent un équilibre dynamique. Dans des conditions pathologiques, une augmentation significative des VE dans la circulation contribue à l’hypercoagulabilité, en particulier chez les patients souffrant de traumatismes crâniens, de prééclampsie, de fractures et de divers types de cancer¹³. Actuellement, l’évaluation de l’état de la coagulation dans les laboratoires cliniques implique principalement l’évaluation du système de coagulation, du système d’anticoagulation et de la fibrinolyse 14,15,16,17. Le temps de prothrombine, le temps de thromboplastine partielle activée, le temps de thrombine et le rapport normalisé international sont couramment utilisés pour évaluer les niveaux de facteurs de coagulation dans le système de coagulation¹⁸. Cependant, des études récentes ont révélé que ces tests ne reflètent pas entièrement l’hypercoagulabilité de certaines maladies¹⁹. D’autres méthodes de dosage, telles que la thromboélastométrie (TEG), la TEG rotationnelle et l’analyse Sonocolot, mesurent les changements viscoélastiques du sang total^20,21. Étant donné que les échantillons de sang total contiennent de nombreuses cellules sanguines et plaquettes, ces tests sont plus susceptibles d’indiquer l’état de coagulation de l’échantillon dans son ensemble. Certains chercheurs ont fait état du rôle des cellules sanguines et des plaquettes dans l’activité procoagulante^22,23. Une étude récente a également révélé que les tests de fonction de coagulation antérieurs ont des difficultés à détecter les changements dans l’activité procoagulante des microparticules²⁴. Par conséquent, une hypothèse a été proposée selon laquelle la fonction procoagulante des VE peut être évaluée par des mesures viscoélastiques du temps de coagulation activée (ACT) dans le plasma riche en VE.

Protocol

La collecte d’échantillons humains a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de l’hôpital général de l’Université médicale de Tianjin. La collecte de sang veineux humain a strictement suivi les directives émises par la Commission nationale de la santé de Chine, à savoir WS/T 661-2020 Directive pour la collecte d’échantillons de sang veineux. Brièvement, du sang a été prélevé sur des personnes en bonne santé avec le consentement éclairé de la veine brachiale antérieure, et les éc…

Representative Results

Le temps d’activation de la thrombine du plasma riche en VE a été mesuré à l’aide d’un analyseur viscoélastique pour la mesure du temps de coagulation plasmatique. La machine se compose de quatre composants principaux : un convertisseur de signal électronique, une sonde, un réservoir de détection et un élément chauffant (Figure 1A,B). La sonde utilise des oscillations à haute fréquence et à faible amplitude pour détecter les changements de viscosité du p…

Discussion

Dans cette étude, la préparation de plasma riche en VE a été décrite, et la rationalité de la méthode a été vérifiée à l’aide de la cytométrie en flux. Par la suite, les échantillons de plasma recalcifié ont été analysés pour le temps d’ACT à l’aide d’un analyseur de caillots basé sur les principes de viscoélasticité²⁴. Comme le montre la figure 3A, on a constaté que la concentration de VE obtenue par ultracentrifugation raccourcissait l…

Materials

AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.