ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर PINK1B9-अशक्त उत्परिवर्ती में उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषण करना
Summary
यहां हम PINK1B9-नल उत्परिवर्ती फल मक्खियों में बायोएनेरगेटिक्स का विश्लेषण करने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। विधि सब्सट्रेट-अनकपलर-इनहिबिटर-अनुमापन (SUIT) प्रोटोकॉल का उपयोग करती है।
Abstract
पार्किंसंस रोग (पीडी) सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, और कैंसर जैसे सेलुलर गड़बड़ी कुछ ऐसे विकार हैं जो माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों की हानि के साथ ऊर्जा चयापचय को बाधित करते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया ऐसे अंग हैं जो कोशिका के अस्तित्व और मृत्यु में शामिल ऊर्जा चयापचय और सेलुलर प्रक्रियाओं दोनों को नियंत्रित करते हैं। इस कारण से, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के दृष्टिकोण रोग और शारीरिक प्रक्रियाओं में सेलुलर स्थितियों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। इस संबंध में, उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री (एचआरआर) प्रोटोकॉल पूरे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला समारोह या विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों की गतिविधि के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी और बायोएनेरगेटिक्स का अध्ययन करने के लिए आनुवंशिक रूप से और प्रयोगात्मक रूप से ट्रैक्टेबल मॉडल जैसे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की आवश्यकता होती है।
यह मॉडल कई फायदे प्रस्तुत करता है, जैसे कि मानव शरीर क्रिया विज्ञान के लिए इसकी समानता, इसका तीव्र जीवन चक्र, आसान रखरखाव, लागत-प्रभावशीलता, उच्च थ्रूपुट क्षमताएं और नैतिक चिंताओं की एक न्यूनतम संख्या। ये विशेषताएँ सामूहिक रूप से इसे जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं को विदारक करने के लिए एक अमूल्य उपकरण के रूप में स्थापित करती हैं। वर्तमान कार्य बताता है कि ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर PINK1B9-नल म्यूटेंट का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषण कैसे किया जाए। गुलाबी 1 जीन पीटीईएन-प्रेरित ख्यात किनेज 1 को एन्कोडिंग के लिए जिम्मेदार है, एक प्रक्रिया के माध्यम से माइटोफैगी के रूप में मान्यता प्राप्त है, जो माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क से बेकार माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। इस जीन में उत्परिवर्तन पीडी के एक ऑटोसोमल रिसेसिव प्रारंभिक-शुरुआत पारिवारिक रूप से जुड़े हुए हैं। इस मॉडल का उपयोग पीडी के पैथोफिज़ियोलॉजी में शामिल माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर ऑर्गेनेल हैं जो महत्वपूर्ण कार्यों को नियंत्रित करते हैं, जिसमें एपोप्टोटिक विनियमन, कैल्शियम होमियोस्टेसिस और बायोसिंथेटिक मार्गों में भागीदारी शामिल है। स्वायत्त आनुवंशिक सामग्री रखने से, वे सेलुलर रखरखाव और मरम्मत प्रक्रियाओं में योगदान करने में सक्षम हैं। उनकी संरचना में इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला और ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण होता है, दोनों सेलुलर ऊर्जा 1,2,3 के लिए महत्वपूर्ण हैं। विशेष रूप से, ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (ओएक्सएफओएस)2के माध्यम से एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पादन के माध्यम से ऊर्जा नियंत्रण प्राप्त किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों की हानि के साथ ऊर्जा चयापचय का विघटन सेल अस्तित्व और मृत्यु 4,5 दोनों में होता है, जो अक्सर मानव विकृति की एक विस्तृत श्रृंखला से जुड़ा होता है, जैसे कैंसर, और पार्किंसंस रोग (पीडी)3,6जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग।
पीडी एक पुरानी, प्रगतिशील और तंत्रिका संबंधी विकार है। इस बीमारी का प्राथमिक कारण मस्तिष्क कोशिकाओं की मृत्यु है, विशेष रूप से पर्याप्त नाइग्रा में, जो न्यूरोट्रांसमीटर डोपामाइन के उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं, जो आंदोलन 6,7,8 को नियंत्रित करता है। पार्किंसनिज़्म को माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जोड़ने वाला सबसे पहला अवलोकन 1988 में किया गया था, प्रयोगात्मक मॉडल में विषाक्त पदार्थों का उपयोग करके जो श्वसन श्रृंखला कॉम्प्लेक्स I9 को रोकते हैं।
वर्तमान में, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन10,11,12,1 3 का मूल्यांकन करने के लिए कई तरीके हैं; हालांकि, पारंपरिक दृष्टिकोण की तुलना में, उच्च संकल्प respirometry (एचआरआर) बेहतर संवेदनशीलता और लाभ13,14 प्रस्तुत करता है. उदाहरण के लिए, एचआरआर प्रोटोकॉल पूरे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला समारोह या विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल परिसरों14,15 की गतिविधि के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का मूल्यांकन बरकरार कोशिकाओं, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया, या यहां तक कि पूर्व विवो10,11,13,14 में किया जा सकता है।
माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन कई रोग और शारीरिक प्रक्रियाओं के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं। इसलिए आनुवंशिक और प्रयोगात्मक रूप से ट्रैक्टेबल मॉडल सिस्टम का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी और बायोएनेरगेटिक्स का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। इस संबंध में, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, फल मक्खी पर शोध के कई फायदे हैं। यह मॉडल मनुष्यों के साथ मौलिक सेलुलर विशेषताओं और प्रक्रियाओं को साझा करता है, जिसमें आनुवंशिक सामग्री, सामान्य जीवों के रूप में डीएनए का उपयोग और विकास, प्रतिरक्षा और सेल सिग्नलिंग में शामिल आणविक मार्गों को संरक्षित करना शामिल है। इसके अलावा, फल मक्खियों एक तेजी से जीवन चक्र, आसान रखरखाव, कम लागत, उच्च throughput, और कम नैतिक चिंताओं है, इस प्रकार जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं 16,17,18,19,20 विदारक के लिए एक अमूल्य उपकरण का गठन.
इसके अलावा, पीटीईएन-प्रेरित ख्यात किनेज 1 (गुलाबी 1) जीन का एक होमोलॉग डी. मेलानोगास्टर में व्यक्त किया गया है। यह माइटोफैगी8 की प्रक्रिया के माध्यम से क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। मनुष्यों में, इस जीन में उत्परिवर्तन व्यक्तियों को माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन 8,21,22,23से जुड़े पीडी के एक ऑटोसोमल रिसेसिव पारिवारिक रूप में पूर्वनिर्धारित करते हैं। नतीजतन, फल मक्खी पीडी के पैथोफिज़ियोलॉजी पर अध्ययन और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और बायोएनेरगेटिक्स पर ध्यान केंद्रित करने वाले दवा उम्मीदवारों की स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल है। इसलिए, वर्तमान कार्य बताता है कि सब्सट्रेट-अनकपलर-इनहिबिटर-टाइट्रेशन (एसयूआईटी) प्रोटोकॉल के साथ ओरोबोरोस में एचआरआर तकनीक का उपयोग करके डी मेलानोगास्टर से पीडी के एक मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषण कैसे किया जाए।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचआरआर माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ऊर्जा चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है डी. मेलानोगास्टर और अन्य जीव। यह माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का एक विस्तृत और मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान कर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ब्राजील की एजेंसी Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020) को स्वीकार करते हैं। P.M. (#88887.512821/2020-00) और TD (#88887.512883/2020-00) रिसर्च फेलोशिप प्राप्तकर्ता हैं।
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
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