Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie
Summary
Hier presenteren we een respirometrieprotocol met hoge resolutie om bio-energetica in PINK1B9-null mutante fruitvliegjes te analyseren. De methode maakt gebruik van het SUIT-protocol (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Abstract
Neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), en cellulaire stoornissen zoals kanker zijn enkele van de aandoeningen die het energiemetabolisme verstoren met verslechtering van de mitochondriale functies. Mitochondriën zijn organellen die zowel het energiemetabolisme als de cellulaire processen regelen die betrokken zijn bij de overleving en dood van cellen. Om deze reden kunnen benaderingen om de mitochondriale functie te evalueren belangrijke inzichten bieden in cellulaire omstandigheden in pathologische en fysiologische processen. In dit opzicht maken protocollen voor respirometrie met hoge resolutie (HRR) evaluatie mogelijk van de gehele functie van de mitochondriale ademhalingsketen of de activiteit van specifieke mitochondriale complexen. Bovendien vereist het bestuderen van mitochondriale fysiologie en bio-energetica genetisch en experimenteel handelbare modellen zoals Drosophila melanogaster.
Dit model biedt verschillende voordelen, zoals de gelijkenis met de menselijke fysiologie, de snelle levenscyclus, eenvoudig onderhoud, kosteneffectiviteit, hoge doorvoermogelijkheden en een minimaal aantal ethische bezwaren. Deze eigenschappen maken het samen tot een hulpmiddel van onschatbare waarde voor het ontleden van complexe cellulaire processen. Het huidige werk legt uit hoe de mitochondriale functie kan worden geanalyseerd met behulp van de Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-mutant. Het pink1-gen is verantwoordelijk voor het coderen voor PTEN-geïnduceerd vermeend kinase 1, via een proces dat wordt erkend als mitofagie, wat cruciaal is voor de verwijdering van disfunctionele mitochondriën uit het mitochondriale netwerk. Mutaties in dit gen werden in verband gebracht met een autosomaal recessieve familiale vorm van PD met vroege aanvang. Dit model kan worden gebruikt om mitochondriale disfunctie te bestuderen die betrokken is bij de pathofysiologie van PD.
Introduction
Mitochondriën zijn cellulaire organellen die belangrijke functies regelen, waaronder apoptotische regulatie, calciumhomeostase en deelname aan biosynthetische routes. Door autonoom genetisch materiaal te bezitten, zijn ze in staat om bij te dragen aan cellulaire onderhouds- en herstelprocessen. Hun structuur herbergt de elektronentransportketen en oxidatieve fosforylering, beide cruciaal voor cellulaire energie 1,2,3. Energiebeheersing wordt met name bereikt door de productie van adenosinetrifosfaat (ATP) via oxidatieve fosforylering (OXPHOS)2. Verstoring van het energiemetabolisme met aantasting van mitochondriale functies treedt zowel op bij celoverleving als bij celdood 4,5, vaak geassocieerd met een breed scala aan menselijke pathologieën, zoals kanker, en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson (PD)3,6.
PD is een chronische, progressieve en neurologische aandoening. De primaire oorzaak van deze ziekte is het afsterven van hersencellen, vooral in de substantia nigra, die verantwoordelijk zijn voor de productie van de neurotransmitter dopamine, die beweging regelt 6,7,8. De vroegste waarneming die parkinsonisme in verband bracht met mitochondriale disfunctie werd gedaan in 1988, in experimentele modellen met toxines die de ademhalingsketen remmen Complex I9.
Momenteel zijn er verschillende methoden om mitochondriale disfunctie te evalueren 10,11,12,1 3; in vergelijking met conventionele benaderingen biedt respirometrie met hoge resolutie (HRR) echter een superieure gevoeligheid en voordelen 13,14. HRR-protocollen maken bijvoorbeeld de evaluatie mogelijk van de hele mitochondriale ademhalingsketenfunctie of de activiteit van specifieke mitochondriale complexen14,15. Mitochondriale disfuncties kunnen worden beoordeeld in intacte cellen, geïsoleerde mitochondriën of zelfs ex vivo 10,11,13,14.
Mitochondriale disfuncties zijn nauw verbonden met veel pathologische en fysiologische processen. Het is daarom belangrijk om mitochondriale fysiologie en bio-energetica te bestuderen met behulp van genetisch en experimenteel handelbare modelsystemen. In dit opzicht heeft onderzoek naar Drosophila melanogaster, de fruitvlieg, verschillende voordelen. Dit model deelt fundamentele cellulaire kenmerken en processen met mensen, waaronder het gebruik van DNA als genetisch materiaal, gemeenschappelijke organellen en geconserveerde moleculaire routes die betrokken zijn bij ontwikkeling, immuniteit en celsignalering. Bovendien hebben fruitvliegjes een snelle levenscyclus, eenvoudig onderhoud, lage kosten, hoge doorvoer en minder ethische bezwaren, waardoor ze een hulpmiddel van onschatbare waarde vormen voor het ontleden van complexe cellulaire processen 16,17,18,19,20.
Bovendien wordt een homoloog van het PTEN-geïnduceerde vermeende kinase 1 (pink1)-gen tot expressie gebracht in D. melanogaster. Het speelt een cruciale rol bij het verwijderen van beschadigde mitochondriën door het proces van mitofagie8. Bij mensen maken mutaties in dit gen individuen vatbaar voor een autosomaal recessieve familiale vorm van PD geassocieerd met mitochondriale disfunctie 8,21,22,23. Bijgevolg is de fruitvlieg een krachtig diermodel voor studies naar de pathofysiologie van PD en screening van kandidaat-geneesmiddelen met de nadruk op mitochondriale disfunctie en bio-energetica. Daarom legt het huidige werk uit hoe de mitochondriale functie kan worden geanalyseerd in een model van PD van D. melanogaster met behulp van de HRR-techniek in de OROBOROS met het Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT)-protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
HRR is een krachtige techniek voor het bestuderen van mitochondriale ademhaling en energiemetabolisme in D. melanogaster en andere organismen. Het biedt een gedetailleerde en kwantitatieve beoordeling van de mitochondriale functie, waardoor onderzoekers inzicht kunnen krijgen in de bio-energetica van de cellen. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de evaluatie van de functie van de mitochondriale ademhalingsketen en de activiteit van specifieke mitochondriale complexen met behulp van het SUIT-protocol bij…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen het Braziliaanse agentschap Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). PM (#88887.512821/2020-00) en TD (#88887.512883/2020-00) zijn ontvangers van onderzoeksbeurzen.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. 유전학. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
